वर्तमान प्रोटोकॉल जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, माइक्रोबायोम या अन्य परखों में इनपुट के लिए हाथ से वयस्क केनोरहाब्डिस एलिगेंस नेमाटोड कीड़े से आंतों को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
केवल 20 कोशिकाओं से युक्त, केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत पाचन, चयापचय, उम्र बढ़ने, प्रतिरक्षा और पर्यावरणीय प्रतिक्रिया सहित कई जीवन-सहायक कार्यों का गठजोड़ है। एलिगेंस होस्ट और उसके पर्यावरण के बीच महत्वपूर्ण बातचीत आंत के भीतर अभिसरण करती है, जहां आंत माइक्रोबायोटा केंद्रित होता है। इसलिए, आंत-विशिष्ट प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए आंत के ऊतकों को बाकी कीड़े से दूर करने की क्षमता आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल वयस्क सी एलिगेंस आंतों को हाथ से विच्छेदित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। प्रक्रिया को आसानी या प्रशिक्षण उद्देश्यों के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल उपभेदों में किया जा सकता है। एक बार तकनीक पूरी हो जाने के बाद, आंतों को किसी भी जीनोटाइप के बिना लेबल वाले कीड़े से एकत्र किया जा सकता है। यह माइक्रोडिसेक्शन दृष्टिकोण मेजबान आंतों के ऊतकों और आंत माइक्रोबायोटा के एक साथ कैप्चर के लिए अनुमति देता है, जो कई माइक्रोबायोम अध्ययनों के लिए एक लाभ है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न आंतों की तैयारी के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में शामिल हो सकते हैं लेकिन आंतों की कोशिकाओं से आरएनए अलगाव और कैप्चर किए गए माइक्रोबायोटा से डीएनए अलगाव तक सीमित नहीं हैं। कुल मिलाकर, सी एलिगेंस आंतों का हाथ विच्छेदन आंत जीव विज्ञान के महत्वपूर्ण पहलुओं की जांच करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि प्रदान करता है।
केनोरहाब्डिस एलिगेंस नेमाटोड वर्म, केवल 959 कोशिकाओं और 4 दिन के अंडे से अंडे के जीवन चक्र के साथ, कई आनुवंशिकी, जीनोमिक्स और विकास ता्मक अध्ययनोंके लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है। आगे और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग में आसानी, इंजीनियर फ्लोरोसेंट मार्करों की व्यापकता, न्यूक्लियोटाइड-विशिष्ट जीनोम संपादन करने की क्षमता, और कई समुदाय-व्यापी संसाधनों ने सभी ने सी एलिगेंस प्रणाली में प्रमुख खोजों और अंतर्दृष्टि में योगदान दिया है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण दोष कोशिकाओं, ऊतकों या अंगों की शुद्ध आबादी प्राप्त करने की कठिनाई है, जो छोटे, नाजुक हैं, और परस्पर जुड़े हो सकते हैं। चूंकि कोशिकाओं की शुद्ध आबादी जीनोमिक्स परख जैसे आरएनए-सेक, सीएचआईपी-सेक और एटीएसी-सेक के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए सी एलिगेंस कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की शुद्ध तैयारी प्राप्त करने के लिए कई दृष्टिकोण सामने आए हैं। यहां, वयस्क सी एलिगेंस कीड़े से बड़े वर्गों में आंतों को हाथ से विच्छेदित करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। परिणामी तैयारी डाउनस्ट्रीम जीनोमिक्स परख (चित्रा 1) के लिए उपयुक्त हैं।
यहां वर्णित ठीक पैमाने पर ऊतक विच्छेदन विधि (चित्रा 2) सिर्फ एक दृष्टिकोण है। अन्य वैकल्पिक तकनीकों – जैसे आणविक टैगिंग, कीड़े को अलग करना, और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और पोस्ट हॉक विश्लेषण के साथ सेल प्रकारों को शुद्ध करना – सी एलिगेंस आणविक जीव विज्ञान की ऊतक-विशिष्ट विशेषताओं का सर्वेक्षण करने के लिए भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इन अन्य दृष्टिकोणों पर हाथ विच्छेदन का एक लाभ, हालांकि, यह है कि इसका उपयोग सी एलिगेंस आंत और इसकी जीवाणु सामग्री 3,4,5 की विशेषताओं का एक साथ पता लगानेके लिए किया जा सकता है। यह 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण को सक्षम बनाता है और सी एलिगेंस प्रणाली के भीतर माइक्रोबायोम अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि आंतों की कोशिकाएं व्यक्तिगत रूप से अलग नहीं होती हैं।
आणविक टैगिंग केवल निर्दिष्ट ऊतक या रुचि की कोशिकाओं के भीतर अणुओं को एक सेल प्रकार-विशिष्ट टैग प्रदान करती है। इन टैग को तब कुल कृमि तैयारी से अलग किया जा सकता है। इस तरह, टैग किए गए पॉलीए-बाइंडिंग प्रोटीन या स्प्लिस्ड लीडर को चलाने वाले ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों ने ऊतक-विशिष्ट ट्रांसस्क्रिप्टम प्रोफाइलिंग 6,7,8,9,10 और 3’यूटीआर मैपिंग11,12 को सक्षम किया है। इसी तरह, ऊतक-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक प्रोफाइल को CHIP-seq और DAMID का उपयोग करके आयोजित किया गया है, जिसमें प्रमोटर-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक वेरिएंट को टैग या एंजाइम संलयन13,14 के साथ जोड़ा गया था।
एफएसीएस उनके आंतरिक सेलुलर विशेषताओं और फ्लोरोसेंट गुणों के आधार पर अलग किए गए कीड़े से सेल प्रकार के हित को अलग करने की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण ने विभिन्न अंगों 8,15,16 और व्यक्तिगत न्यूरोनल सेल प्रकार 8,9,15,16,17,18 से ऊतक-विशिष्ट ट्रांसस्क्रिप्टम उत्पन्न किए हैं और इसका उपयोग पूरे सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र 19,20 का अभिव्यक्ति मानचित्र बनाने के लिए किया गया है। . एफएसीएस, और इसके चचेरे भाई प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक सॉर्टिंग (एफएएनएस), का उपयोग सेल-विशिष्ट क्रोमैटिन प्रोफाइल21,22 उत्पन्न करने के लिए भी किया गया है।
अंत में, पोस्ट-हॉक विश्लेषण एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन परख में किया जा सकता है। इस विधि में, सभी अलग-अलग कोशिकाओं का सर्वेक्षण किया जाता है, प्रत्येक के सेल प्रकार को विश्लेषण चरण में रखा जाता है, और सेल प्रकार की रुचि को आगे के अध्ययन के लिए चुनिंदा रूप से फ़िल्टर किया जाता है। सी एलिगेंस भ्रूण 23,24,25,26,27 और एल 128 चरण कीड़े में उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प दोनों के साथ विकासशील कोशिकाओं के प्रतिलेख प्राप्त करने के लिए पोस्ट-हॉक विश्लेषण का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। क्रोमैटिन पहुंच को एक समान रणनीति 29 का उपयोग करके आरएनए-सेक के बजाय एटीएसी-सेक का उपयोग करके भीचित्रित किया गया है।
प्रत्येक दृष्टिकोण के अपने फायदे और सीमाएं हैं। एलिगेंस आंत के लिए, आंत्र कोशिकाओं के कृमि विघटन और एफएसीएस अलगाव भ्रूण और लार्वा चरण30 में प्राप्त करने योग्य है लेकिन वयस्कों में चुनौतीपूर्ण है। यह आंत की बड़ी, एंडो-रिडुप्लिकेटेड और दृढ़ता से अनुयायी कोशिकाओं के कारण माना जाता है, जिससे उन्हें बिना क्षतिग्रस्त को अलग करना मुश्किल हो जाता है। यहां वर्णित हाथ विच्छेदन विधि इन चुनौतियों को दरकिनार करती है, जिससे वयस्क कीड़े की आंत के बड़े हिस्सों के अलगाव की अनुमति मिलती है। इस चरण से गोनाड को हाथ से विच्छेदित करने का अभ्यास व्यापक और सीधा है। आंत विच्छेदन गोनाड विच्छेदन के समान है लेकिन आमतौर पर कम कियाजाता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल डॉ जेम्स मैकघी और बार्ब गोज़ज़िन्स्की द्वारा विकसित एक लंबे, अप्रकाशित प्रोटोकॉल से अनुकूलित है। यह सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण के भ्रूण 23,33,34,35 से ब्लास्टोमेरेस को अलग करने के लिए तकनीकों को उधार लेता है। हालांकि सी एलिगेंस में अधिकांश कोशिका या ऊतक प्रकारों को अलग करने के लिए हाथ विच्छेदन संभव नहीं है, यह वयस्क कीड़े से आंतों को अलग करने के लिए आदर्श है। इसलिए, हाथ विच्छेदन आंत-विशिष्ट सेल तैयारी प्राप्त करने के लिए अन्य साधनों का पूरक है।
यह लेख वयस्क सी एलिगेंस से आंतों को हाथ से विच्छेदित करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिससे डाउनस्ट्रीम परख के लिए शुद्ध तैयारी उत्पन्न होती है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में (1) यह सुनिश्चित करना शामिल है कि कीड़े को अधिक लकवाग्रस्त न किया जाए, (2) सटीक विच्छेदन कटौती करना, (3) विच्छेदन के लिए उचित आकार के माइक्रो-पिपेट बनाना, और (4) अंतिम फसल के दौरान स्वस्थ आंतों की शीघ्र वसूली सुनिश्चित करना। इन कारणों से, कीड़े को लेवमिसोल समाधान में उजागर करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, और अधिकतम तीखेपन को सुनिश्चित करने के लिए हाइपोडर्मिक सुइयों को अक्सर ताज़ा करने की आवश्यकता होती है। माइक्रोकेशिका पिपेट और मुंह के श्वासयंत्र का उपयोग करके आंत को संभालना एक और कदम है जो अभ्यास करेगा। उचित आकार के ठीक से जाली माइक्रो-पिपेट भी सूक्ष्म-पिपेट के भीतर आंतों को खोने के जोखिम को कम करने के अलावा विच्छेदन के दौरान आंत के बड़े हिस्सों को अलग करने में पर्याप्त अंतर बनाते हैं। नए प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता आमतौर पर माइक्रोकेशिका पिपेट के आंतरिक किनारे पर आंतों को खो देते हैं, इससे पहले कि उन्हें अलगाव अभिकर्मक में बाहर निकाला जा सके। इस समस्या को अभ्यास के साथ संशोधित किया जा सकता है और ठीक से जाली माइक्रोकेशिका पिपेट।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया था। प्रारंभिक परीक्षण समर्थन करते हैं कि यह प्रोटोकॉल एल 4 कीड़े और पुराने वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए भी प्रभावी है। हालांकि, प्रारंभिक लार्वा चरण कीड़े में इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का अभी तक मूल्यांकन नहीं किया गया है। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि इससे मिलने वाली सामग्री की छोटी मात्रा है। हालांकि मात्रा आरएनए-सेक और पीसीआर के लिए पर्याप्त है, लेकिन वे अन्य परखों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। जैसे, उपयोगकर्ताओं को यह निर्धारित करने की आवश्यकता है कि क्या परख के लिए न्यूनतम आवश्यक इनपुट को इस प्रोटोकॉल के साथ आसानी से एकत्र किया जा सकता है।
हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप से अलगाव30 के बाद आंतों की कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एफएसीएस का उपयोग करती है, आंतों की कोशिका पहचान के लिए पोस्ट-हॉक विश्लेषण विधियां, और यह हाथ विच्छेदन विधि30,42। हाथ विच्छेदन में वयस्क कीड़े में उपयोग के लिए उत्तरदायी होने का लाभ होता है जब कृमि विघटन और कोशिका अलगाव कम सफल होते हैं। इसके अलावा, हाथ विच्छेदन की तैयारी से निकाले गए कुल आरएनए की दक्षता और गुणवत्ता अधिक है, संभवतः क्योंकि ऊतकों को कीड़े से तेजी से तोड़ा जाता है और फिर जल्दी से न्यूक्लिक एसिड अलगाव अभिकर्मक में जमा किया जाता है, जिससे आरएनए क्षरण कम हो जाता है। हाथ विच्छेदन विधि का एक और लाभ यह है कि यह कम लागत, सीखने में आसान है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। अंत में, यह दृष्टिकोण कृमि आंतों से आंत बैक्टीरिया की फसल और अलगाव की अनुमति देता है, जिससे डाउनस्ट्रीम माइक्रोबायोम अध्ययन सक्षम होता है।
वयस्क सी एलिगेंस से आंतों को अलग करने के लिए यहां वर्णित हाथ विच्छेदन प्रोटोकॉल सी एलिगेंस जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, आंतों की शुद्ध तैयारी के साथ, शोधकर्ता प्रतिरक्षा, उम्र बढ़ने, चयापचय और माइक्रोबायोम के बीच चौराहे की जांच कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम जेम्स मैकघी और बारब गोस्ज़िन्स्की के अग्रणी काम के ऋणी हैं, जिन्होंने शुरू में आंत विच्छेदन विधि विकसित की थी जिससे इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है। हमारे काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, आर 35 जीएम 124877 टू ईओएन) द्वारा देखरेख में एक मीरा (आर 35) पुरस्कार और एनएसएफ एमसीबी डिवीजन ऑफ मॉलिक्यूलर एंड सेलुलर बायोसाइंस (ईओएन को पुरस्कार # 2143849) द्वारा देखरेख में एक एनएसएफ-करियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया है।
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |