JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Neurosciences

Karakterisering av neuronal lysosominteraktom med nærhetsmerking proteomikk

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

En neuronal lysosom nærhetsmerking proteomikkprotokoll er beskrevet her for å karakterisere det dynamiske lysosomale mikromiljøet i humaninduserte pluripotente stamcelleavledede nevroner. Lysosomale membranproteiner og proteiner som interagerer med lysosomer (stabilt eller forbigående) kan kvantifiseres nøyaktig i denne metoden med utmerket intracellulær romlig oppløsning i levende humane nevroner.

Abstract

Lysosomer kommuniserer ofte med en rekke biomolekyler for å oppnå nedbrytning og andre forskjellige cellulære funksjoner. Lysosomer er kritiske for menneskelig hjernefunksjon, da nevroner er postmitotiske og stole sterkt på autofagi-lysosomveien for å opprettholde cellulær homeostase. Til tross for fremskritt i forståelsen av ulike lysosomale funksjoner, er det teknisk utfordrende å fange den svært dynamiske kommunikasjonen mellom lysosomer og andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Her er en detaljert protokoll gitt for den nylig publiserte endogene (knock-in) lysosom-nærhetsmerkingsproteomiske metoden i humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC) -avledede nevroner.

Både lysosomale membranproteiner og proteiner som omgir lysosomer innenfor en radius på 10-20 nm, kan trygt identifiseres og kvantifiseres nøyaktig i levende humane nevroner. Hvert trinn i protokollen er beskrevet i detalj, dvs. hiPSC-nevronkultur, nærhetsmerking, nevronhøsting, fluorescensmikroskopi, biotinylert proteinberikelse, proteinfordøyelse, LC-MS-analyse og dataanalyse. Oppsummert gir denne unike endogene lysosomale nærhetsmerkingsproteomikkmetoden et høyt gjennomstrømnings- og robust analytisk verktøy for å studere de svært dynamiske lysosomale aktivitetene i levende menneskelige nevroner.

Introduction

Lysosomer er katabolske organeller som nedbryter makromolekyler via lysosomal-autofagi-banen1. Foruten nedbrytning er lysosomer involvert i ulike cellulære funksjoner som signaltransduksjon, næringsmåling og sekresjon 2,3,4. Forstyrrelser i lysosomal funksjon har vært involvert i lysosomale lagringsforstyrrelser, kreft, aldring og nevrodegenerasjon 3,5,6,7. For postmitotiske og svært polariserte nevroner spiller lysosomer kritiske roller i nevronal cellulær homeostase, nevrotransmitterfrigivelse og langdistansetransport langs axonene 8,9,10,11. Imidlertid har det vært en utfordrende oppgave å undersøke lysosomer i humane nevroner. Nylige fremskritt i indusert pluripotent stamcelle (iPSC) -avledet nevronteknologi har muliggjort kulturen av levende menneskelige nevroner som tidligere var utilgjengelige, og bygger bro over gapet mellom dyremodeller og menneskelige pasienter for å studere den menneskelige hjerne12,13. Spesielt integrerer den avanserte i3Neuron-teknologien stabilt neurogenin-2-transkripsjonsfaktoren i iPSC-genomet under en doxycyklinin-induserbar promotor, og driver iPSC-er til å differensiere til rene kortikale nevroner i 2 uker14,15.

På grunn av den svært dynamiske lysosomale aktiviteten er det teknisk utfordrende å fange lysosomale interaksjoner med andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Nærhetsmerkingsteknologi er godt egnet til å studere disse dynamiske interaksjonene på grunn av sin evne til å fange både stabile og forbigående / svake proteininteraksjoner med eksepsjonell romlig spesifisitet16,17. Konstruert peroksidase eller biotin ligase kan genetisk smeltes til agnproteinet. Ved aktivering produseres svært reaktive biotinradikaler for å kovalent merke naboproteiner, som deretter kan berikes av streptavidinbelagte perler for nedstrøms bottom-up proteomikk via flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) plattformer 17,18,19,20,21.

En endogen lysosomal nærhetsmerkingsproteomikkmetode ble nylig utviklet for å fange det dynamiske lysosomale mikromiljøet i i3Neurons22. Konstruert askorbatperoksidase (APEX2) ble slått inn på C-enden av det lysosomale assosierte membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som deretter kan differensieres til kortikale nevroner. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk lysosomal markør23. LAMP1 uttrykkes også i sene endosomer, som modnes til lysosomer; Disse sene endosom-lysosomene og ikke-nedbrytende lysosomene er alle referert til som lysosomer i denne protokollen. Denne endogene LAMP1-APEX-sonden, uttrykt på fysiologisk nivå, kan redusere LAMP1-feillokaliserings- og overuttrykksartefakter. Hundrevis av lysosomale membranproteiner og lysosomale interaktorer kan identifiseres og kvantifiseres med utmerket romlig oppløsning i levende menneskelige nevroner.

Her beskrives en detaljert protokoll for lysosom-nærhetsmerking av proteomikk i humane iPSC-avledede nevroner med ytterligere forbedringer fra den nylig publiserte metoden22. Den generelle arbeidsflyten er illustrert i figur 1. Protokollen inkluderer hiPSC-avledet nevronkultur, nærhetsmerkingsaktivering i nevroner, validering av APEX-aktivitet ved fluorescensmikroskopi, bestemmelse av et optimalt streptavidinperler-til-inngang-proteinforhold, anrikning av biotinylerte proteiner, on-beads proteinfordøyelse, peptidavsalting og kvantifisering, LC-MS-analyse og proteomikkdataanalyse. Feilsøkingsretningslinjer og eksperimentelle optimaliseringer diskuteres også for å forbedre nærhetsmerking kvalitetskontroll og ytelse.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av George Washington University biosikkerhets- og etikkkomité. Sammensetningene av medier og buffere som brukes i denne protokollen er gitt i tabell 1. Den kommersielle produktinformasjonen som brukes her, er gitt i materialtabellen. 1. Human iPSC-avledet nevronkultur Integrering av iPSC-kultur og LAMP1-APEX-sonde (7 dager)Tine Matrigel lagerløsning i en isbøtte ved 4 °C over natten, aliquot 5…

Representative Results

Denne lysosom-nærhetsmerkingsproteomikkstudien ble utført i humane iPSC-avledede nevroner for å fange det dynamiske lysosomale mikromiljøet in situ i levende nevroner. Cellemorfologier av hiPSC og hiPSC-avledede nevroner på forskjellige tidspunkter er illustrert i figur 2A. Humane iPSC-er vokser i kolonier i E8-medium. Differensiering initieres ved plating av iPSCs i doxycyklinholdig nevroninduksjonsmedium. Neurittforlengelser blir mer synlige hver dag i løpet av 3 dagers diff…

Discussion

Ved hjelp av denne LAMP1-APEX-sonden blir proteiner på og nær den lysosomale membranen biotinylert og beriket. Gitt den typiske lysosomdiameteren på 100-1,200 nm, gir denne metoden utmerket intracellulær oppløsning med en 10-20 nm merkingsradius. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk markør for lysosomer, som fungerer som et utmerket agnprotein for lysosomal APEX-merking på endogent uttrykksnivå. Imidlertid eksisterer det også begrensninger ved bruk av LAMP1 for å målrette lysosomer, da …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien støttes av NIH-stipendet (R01NS121608). AMF anerkjenner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship og Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi takker Michael Ward-laboratoriet ved National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) for molekylærbiologisk støtte og i3Neuron-teknologiutviklingen.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

Proximity Labeling ProteomicsLysosomal MicroenvironmentIPSC-derived NeuronsLysosomal DysfunctionBrain DiseasesBiotin PhenolHydrogen PeroxideAcetone PrecipitationProtein PelletDCA Assay
check_url/fr/64132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image