JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Karakterisering av neuronal lysosominteraktom med närhetsmärkning Proteomics

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

Ett neuronalt lysosomnärhetsmärkningsproteomikprotokoll beskrivs här för att karakterisera den dynamiska lysosomala mikromiljön i humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade neuroner. Lysosomala membranproteiner och proteiner som interagerar med lysosomer (stabilt eller övergående) kan kvantifieras exakt i denna metod med utmärkt intracellulär rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.

Abstract

Lysosomer kommunicerar ofta med en mängd olika biomolekyler för att uppnå nedbrytningen och andra olika cellulära funktioner. Lysosomer är avgörande för människans hjärnfunktion, eftersom neuroner är postmitotiska och förlitar sig starkt på autofagi-lysosomvägen för att upprätthålla cellulär homeostas. Trots framsteg i förståelsen av olika lysosomala funktioner är det tekniskt utmanande att fånga den mycket dynamiska kommunikationen mellan lysosomer och andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för den nyligen publicerade endogena (knock-in) lysosomnärhetsmärkningsproteomiska metoden i humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda neuroner.

Både lysosomala membranproteiner och proteiner som omger lysosomer inom en radie på 10-20 nm kan med säkerhet identifieras och kvantifieras exakt i levande mänskliga neuroner. Varje steg i protokollet beskrivs i detalj, dvs hiPSC-neuronkultur, närhetsmärkning, neuronskörd, fluorescensmikroskopi, biotinylerad proteinberikning, proteinsmältning, LC-MS-analys och dataanalys. Sammanfattningsvis ger denna unika endogena lysosomala närhetsmärkningsproteomikmetod ett högt genomströmnings- och robust analytiskt verktyg för att studera de mycket dynamiska lysosomala aktiviteterna i levande mänskliga neuroner.

Introduction

Lysosomer är katabola organeller som bryter ner makromolekyler via lysosomal-autofagivägen1. Förutom nedbrytning är lysosomer involverade i olika cellulära funktioner såsom signaltransduktion, näringsavkänning och utsöndring 2,3,4. Störningar i lysosomal funktion har varit inblandade i lysosomala lagringsstörningar, cancer, åldrande och neurodegeneration 3,5,6,7. För postmitotiska och mycket polariserade neuroner spelar lysosomer kritiska roller i neuronal cellulär homeostas, neurotransmittorfrisättning och långväga transporter längs axonerna 8,9,10,11. Att undersöka lysosomer i mänskliga nervceller har dock varit en utmanande uppgift. De senaste framstegen inom inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har gjort det möjligt för kulturen av levande mänskliga neuroner som tidigare var otillgängliga, vilket överbryggar klyftan mellan djurmodeller och mänskliga patienter för att studera den mänskliga hjärnan12,13. I synnerhet integrerar den avancerade i3Neuron-tekniken stabilt neurogenin-2-transkriptionsfaktorn i iPSC-genomet under en doxycyklininducerbar promotor, vilket driver iPSC att differentiera till rena kortikala neuroner på 2 veckor14,15.

På grund av den mycket dynamiska lysosomala aktiviteten är det tekniskt utmanande att fånga lysosomala interaktioner med andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Närhetsmärkningsteknik är väl lämpad för att studera dessa dynamiska interaktioner på grund av dess förmåga att fånga både stabila och övergående / svaga proteininteraktioner med exceptionell rumslig specificitet16,17. Konstruerat peroxidas eller biotinligas kan genetiskt smältas till betesproteinet. Vid aktivering produceras mycket reaktiva biotinradikaler för att kovalent märka angränsande proteiner, som sedan kan berikas av streptavidinbelagda pärlor för nedströms bottom-up-proteomik via vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) plattformar 17,18,19,20,21.

En endogen lysosomal närhetsmärkning proteomikmetod utvecklades nyligen för att fånga den dynamiska lysosomala mikromiljön i i3Neurons22. Konstruerat askorbatperoxidas (APEX2) slogs in på C-änden av det lysosomala associerade membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som sedan kan differentieras till kortikala neuroner. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk lysosomal markör23. LAMP1 uttrycks också i sena endosomer, som mognar till lysosomer; Dessa sena endosom-lysosomer och icke-nedbrytande lysosomer kallas alla lysosomer i detta protokoll. Denna endogena LAMP1-APEX-sond, uttryckt på fysiologisk nivå, kan minska LAMP1-fellokalisering och överuttrycksartefakter. Hundratals lysosomala membranproteiner och lysosomala interagerande kan identifieras och kvantifieras med utmärkt rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.

Här beskrivs ett detaljerat protokoll för lysosomnärhetsmärkning proteomik i humana iPSC-härledda neuroner med ytterligare förbättringar från den nyligen publicerade metoden22. Det övergripande arbetsflödet visas i figur 1. Protokollet inkluderar hiPSC-härledd neuronkultur, aktivering av närhetsmärkning i neuroner, validering av APEX-aktivitet genom fluorescensmikroskopi, bestämning av ett optimalt streptavidin-pärl-till-input-proteinförhållande, anrikning av biotinylerade proteiner, proteinsmältning på pärlor, peptidavsaltning och kvantifiering, LC-MS-analys och proteomikdataanalys. Felsökningsriktlinjer och experimentella optimeringar diskuteras också för att förbättra kvalitetskontroll och prestanda för närhetsmärkning.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av George Washington University biosäkerhets- och etikkommitté. Sammansättningarna av medier och buffertar som används i detta protokoll anges i tabell 1. Den kommersiella produktinformationen som används här finns i materialförteckningen. 1. Mänsklig iPSC-härledd neuronkultur Mänsklig iPSC-kultur och LAMP1-APEX-sondintegration (7 dagar)Tina Matrigel stamlösning i en ishink vid 4 °C ö…

Representative Results

Denna lysosomnärhetsmärkning proteomikstudie genomfördes i humana iPSC-härledda neuroner för att fånga den dynamiska lysosomala mikromiljön in situ i levande neuroner. Cellmorfologier av hiPSC och hiPSC-härledda neuroner vid olika tidpunkter illustreras i figur 2A. Mänskliga iPSC växer i kolonier i E8-medium. Differentiering initieras genom plätering av iPSC till doxycyklininnehållande neuroninduktionsmedium. Neuritförlängningar blir mer synliga varje dag under 3-dagar…

Discussion

Med hjälp av denna LAMP1-APEX-sond biotinyleras och berikas proteiner på och nära det lysosomala membranet. Med tanke på den typiska lysosomdiametern på 100-1 200 nm ger denna metod utmärkt intracellulär upplösning med en märkningsradie på 10-20 nm. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk markör för lysosomer, som fungerar som ett utmärkt beteprotein för lysosomal APEX-märkning på endogen uttrycksnivå. Det finns dock också begränsningar när man använder LAMP1 för att rikta in…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöds av NIH-anslaget (R01NS121608). A.M.F. erkänner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship och Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi tackar Michael Ward-labbet vid National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) för molekylärbiologiskt stöd och i3Neuron-teknikutvecklingen.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

Proximity Labeling ProteomicsLysosomal MicroenvironmentIPSC-derived NeuronsLysosomal DysfunctionBrain DiseasesBiotin PhenolHydrogen PeroxideAcetone PrecipitationProtein PelletDCA Assay
check_url/fr/64132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image