使用Leginon进行载物台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据收集
Summary
本协议描述了冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据收集的通用且易于实施的方案。对于由于粘附空气-水界面而遭受优先方向偏差的样品，该程序对于获得高质量的EM图特别有用。
Abstract
通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）进行的单颗粒分析（SPA）现在是高分辨率结构生物学的主流技术。SPA的结构测定依赖于获得在薄冰层内玻璃化的大分子物体的多个不同视图。理想情况下，均匀分布的随机投影方向的集合将相当于物体的所有可能视图，从而产生以各向同性方向分辨率为特征的重建。然而，在现实中，许多样品都受到粘附在空气-水界面上的优先取向颗粒的影响。这导致数据集中的角度取向分布不均匀，重建中出现不均匀的傅里叶空间采样，从而转化为以各向异性分辨率为特征的地图。倾斜试样载物台提供了一种可推广的解决方案，通过提高取向分布的均匀性，从而改善傅里叶空间采样的各向同性，克服分辨率各向异性。该协议描述了使用Leginon（一种用于自动图像采集的软件）的倾斜阶段自动数据收集策略。该程序易于实施，不需要任何额外的设备或软件，并且与用于生物大分子成像的大多数标准透射电子显微镜（TEM）兼容。
Introduction
在过去十年中，直接电子探测器1，2，3的出现刺激了使用单粒子冷冻电镜4，5，6解决的大分子和大分子组件的高分辨率结构的数量呈指数级增长。几乎所有纯化的大分子物质都有望使用冷冻电镜进行结构测定，除了最小的蛋白质~10 kDa大小或小于7。网格制备和结构测定所需的起始材料量至少比其他结构测定技术（如核磁共振波谱和X射线晶体学4，5，6）少一个数量级。
然而，通过冷冻电镜测定结构的主要挑战涉及合适的成像网格准备。一项使用不同玻璃化策略和网格评估不同样品的广泛研究表明，在冷冻电镜网格上玻璃化样品的大多数方法都会导致大分子优先粘附在空气-水界面上8。这种依从性可能导致四个次优结果：（1）大分子样品完全变性，在这种情况下，不可能成功的数据收集和处理;（2）样品部分变性，在这种情况下，有可能从未受损的大分子区域获得结构见解;（3）样品保留了天然结构，但图像中仅表示一组相对于电子束方向的粒子取向;（4）样品保留了天然结构，并且图像中表示了相对于电子束方向的一些但不是全部可能的粒子取向。对于情况（3）和（4），倾斜数据收集将有助于最大限度地减少影响重建冷冻电镜图的方向分辨率各向异性，并为各种样品提供可推广的解决方案9。从技术上讲，倾斜也可以使情况（2）受益，因为变性可能发生在空气 – 水界面处，并且同样限制了数据中表示的不同方向的数量。数据集中方向偏差的程度可以通过试验溶液添加剂来改变，但缺乏广泛的适用性阻碍了这些试错法。通过改变成像实验9 的几何形状，以单个优化的倾斜角度倾斜样品台足以改善方向分布（图1）。由于优先取向样品相对于电子束的几何配置，对于每个优先取向的簇，倾斜网格会生成相对于团簇质心的照明角度锥。因此，这分散了视图，从而改善了傅里叶空间采样和方向分辨率的各向同性。
在实践中，倾斜舞台有一些危害。倾斜标本载物台会在视场上引入焦点梯度，这可能会影响对比度传递函数 （CTF） 估计的准确性。倾斜的数据收集还可能导致光束诱导的粒子运动增加，这是由于对倾斜标本进行成像时电荷效应增加引起的。网格倾斜也会导致表观冰厚度增加，这反过来又导致显微照片嘈杂，并可能最终影响重建的分辨率5，9，10。通过应用协议和讨论部分中简要描述的高级计算数据处理方案，可以克服这些问题。最后，倾斜会导致粒子重叠增加，从而阻碍后续的图像处理管道。虽然这可以通过优化网格颗粒浓度在一定程度上缓解，但它仍然是一个重要的考虑因素。这里描述了一种易于实现的协议，用于使用Leginon软件套件（一种自动图像采集软件）进行倾斜数据收集，该套件可开放访问并与各种显微镜11，12，13，14兼容。该方法至少需要版本 3.0 或更高版本，版本 3.3 及更高版本包含专门的改进，以实现倾斜数据收集。此协议不需要额外的软件或设备。有关计算基础结构和安装指南的大量说明在别处提供15.
Protocol
Representative Results
Discussion
由样品粘附在空气-水界面上引起的首选颗粒取向是使用冷冻电镜SPA4，5，6进行常规高分辨率结构测定的最后一个主要瓶颈之一。这里介绍的数据收集方案提供了一种易于实现的策略，用于改善数据集中粒子的方向分布。我们注意到，该协议不需要额外的设备或软件，也不会影响数据收集速度。在倾斜样品的数据采集过程中，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Bill Anderson，Charles Bowman和Jean-Christophe Ducom（TSRI）在显微镜，Leginon安装和数据传输基础设施方面的帮助。我们还要感谢Gordon Louie（Salk Institute）和Yong Zi Tan（新加坡国立大学）对手稿的批判性阅读。我们感谢Chris Russo（剑桥MRC分子生物学实验室）为我们提供表达DPS的质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院（U54AI150472，U54 AI170855和R01AI136680到DL），国家科学基金会（NSF MCB-2048095到DL），赫斯特基金会（到DL）和Arthur和Julie Woodrow主席（对J.P.N.）的资助。
Materials
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
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