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Biochimie

लेगिनन का उपयोग करके स्टेज टिल्ट के साथ सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम डेटा संग्रह

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64136
, , , ,
1Laboratory of Genetics,The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics,The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry,University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology,University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology,The Scripps Research Institute

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम प्रयोगों में झुके हुए एकल-कण डेटा संग्रह के लिए एक सामान्यीकृत और आसानी से लागू होने वाली योजना का वर्णन करता है। इस तरह की प्रक्रिया विशेष रूप से वायु-जल इंटरफ़ेस के पालन के कारण अधिमान्य अभिविन्यास पूर्वाग्रह से पीड़ित नमूनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए उपयोगी है।

Abstract

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) द्वारा एकल-कण विश्लेषण (एसपीए) अब उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक है। एसपीए द्वारा संरचना निर्धारण बर्फ की एक पतली परत के भीतर विट्रीफाइड मैक्रोमोलेक्यूलर ऑब्जेक्ट के कई अलग-अलग दृश्यों को प्राप्त करने पर निर्भर करता है। आदर्श रूप से, समान रूप से वितरित यादृच्छिक प्रक्षेपण उन्मुखता का एक संग्रह वस्तु के सभी संभावित दृश्यों के बराबर होगा, जो आइसोट्रोपिक दिशात्मक संकल्प की विशेषता वाले पुनर्निर्माण को जन्म देगा। हालांकि, वास्तव में, कई नमूने वायु-जल इंटरफ़ेस का पालन करने वाले अधिमान्य रूप से उन्मुख कणों से पीड़ित हैं। यह डेटासेट में गैर-समान कोणीय अभिविन्यास वितरण और पुनर्निर्माण में असंगत फूरियर-स्पेस नमूनाकरण की ओर जाता है, जो अनिसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन की विशेषता वाले मानचित्रों में अनुवाद करता है। नमूना चरण को झुकाना अभिविन्यास वितरण की एकरूपता में सुधार के आधार पर रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी पर काबू पाने के लिए एक सामान्य समाधान प्रदान करता है, और इस प्रकार फूरियर स्पेस सैंपलिंग की आइसोट्रोपी। वर्तमान प्रोटोकॉल स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए एक सॉफ्टवेयर लेगिनन का उपयोग करके एक झुके हुए चरण स्वचालित डेटा संग्रह रणनीति का वर्णन करता है। प्रक्रिया को लागू करना सरल है, किसी भी अतिरिक्त उपकरण या सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है, और इमेजिंग जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश मानक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) के साथ संगत है।

Introduction

पिछले दशक 1,2,3 में प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के आगमन ने एकल-कण क्रायो-ईएम 4,5,6 का उपयोग करके हल किए गए मैक्रोमोलेक्यूल्स और मैक्रोमोलेक्यूलर असेंबली की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं की संख्या में घातीय वृद्धि को प्रेरित किया है। आकार में या7 से नीचे के सबसे छोटे प्रोटीन ~ 10 केडीए को छोड़कर, लगभग सभी शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूलर प्रजातियों को क्रायो-ईएम का उपयोग करके संरचना निर्धारण के लिए उत्तरदायी होने की उम्मीद है। ग्रिड तैयारी और संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा कम से कम अन्य संरचना निर्धारण तकनीकों की तुलना में कम परिमाण का एक क्रम है, जैसे कि परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 4,5,6।

हालांकि, क्रायो-ईएम द्वारा संरचना निर्धारण के लिए एक प्रमुख चुनौती में इमेजिंग के लिए उपयुक्त ग्रिड तैयारी शामिल है। विभिन्न विटिफिकेशन रणनीतियों और ग्रिडों का उपयोग करके विविध नमूनों का मूल्यांकन करने वाले एक व्यापक अध्ययन ने सुझाव दिया कि क्रायो-ईएम ग्रिड पर विट्रीफाइंग नमूनों के लिए अधिकांश दृष्टिकोण वायु-जल इंटरफ़ेस8 के मैक्रोमोलेक्यूल्स के अधिमान्य पालन का कारण बनते हैं। इस तरह के पालन से संभावित रूप से चार उप-मानक परिणाम हो सकते हैं: (1) मैक्रोमोलेक्यूलर नमूना पूरी तरह से विकृत हो जाता है, इस मामले में कोई सफल डेटा संग्रह और प्रसंस्करण संभव नहीं है; (2) नमूना आंशिक रूप से विकृत होता है, इस स्थिति में मैक्रोमोलेक्यूल के क्षेत्रों से संरचनात्मक अंतर्दृष्टि प्राप्त करना संभव हो सकता है जो क्षतिग्रस्त नहीं हैं; (3) नमूना मूल संरचना को बरकरार रखता है, लेकिन इलेक्ट्रॉन बीम की दिशा के सापेक्ष कण उन्मुखता का केवल एक सेट छवियों में दर्शाया गया है; (4) नमूना मूल संरचना को बरकरार रखता है, और इलेक्ट्रॉन बीम की दिशा के सापेक्ष कुछ लेकिन सभी संभावित कण झुकाव छवियों में दर्शाए जाते हैं। मामलों (3) और (4) के लिए, झुका हुआ डेटा संग्रह पुनर्निर्मित क्रायो-ईएम मानचित्र को प्रभावित करने वाले दिशात्मक रिज़ॉल्यूशन अनिसोट्रॉपी को कम करने में मदद करेगा और विभिन्न प्रकार के नमूनोंके लिए एक सामान्य समाधान प्रदान करेगा। तकनीकी रूप से, झुकाव भी मामले (2) को लाभ पहुंचा सकता है, क्योंकि विकृतीकरण संभवतः हवा-पानी इंटरफ़ेस पर होता है और इसी तरह डेटा के भीतर प्रतिनिधित्व किए गए अलग-अलग झुकावों की संख्या को सीमित करता है। डेटासेट में अभिविन्यास पूर्वाग्रह की सीमा को संभावित रूप से समाधान योजक के साथ प्रयोग करके बदला जा सकता है, लेकिन व्यापक प्रयोज्यता की कमी इन परीक्षण-और-त्रुटि दृष्टिकोणों को बाधित करती है। नमूना चरण को एकल अनुकूलित झुकाव कोण पर झुकाना इमेजिंग प्रयोग9 (चित्रा 1) की ज्यामिति को बदलने के आधार पर अभिविन्यास के वितरण में सुधार करने के लिए पर्याप्त है। इलेक्ट्रॉन बीम के संबंध में अधिमान्य-उन्मुख नमूने के ज्यामितीय विन्यास के कारण, अधिमान्य झुकाव के प्रत्येक क्लस्टर के लिए, ग्रिड को झुकाने से क्लस्टर केन्द्रक के संबंध में रोशनी कोणों का एक शंकु उत्पन्न होता है। इसलिए, यह विचारों को फैलाता है और परिणामस्वरूप फूरियर स्पेस सैंपलिंग और दिशात्मक रिज़ॉल्यूशन की आइसोट्रोपी में सुधार होता है।

व्यवहार में, मंच को झुकाने के लिए कुछ नुकसान हैं। नमूना चरण को झुकाना दृश्य के क्षेत्र में एक फोकस ढाल का परिचय देता है, जो कंट्रास्ट ट्रांसफर फ़ंक्शन (सीटीएफ) अनुमानों की सटीकता को प्रभावित कर सकता है। झुके हुए डेटा संग्रह से इमेजिंग झुके हुए नमूनों की इमेजिंग करते समय चार्जिंग प्रभाव में वृद्धि के कारण बीम-प्रेरित कण आंदोलन में वृद्धि हो सकती है। ग्रिड झुकाव से स्पष्ट बर्फ की मोटाई में भी वृद्धि होती है, जो बदले में शोर माइक्रोग्राफ की ओर जाता है और अंततः पुनर्निर्माण 5,9,10 के संकल्प को प्रभावित कर सकता है। प्रोटोकॉल और चर्चा अनुभागों में संक्षेप में वर्णित उन्नत कम्प्यूटेशनल डेटा-प्रोसेसिंग योजनाओं को लागू करके इन मुद्दों को दूर करना संभव हो सकता है। अंत में, झुकाव से कण ओवरलैप में वृद्धि हो सकती है, जिससे बाद की छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन में बाधा आ सकती है। हालांकि इसे ऑन-ग्रिड कण एकाग्रता को अनुकूलित करके कुछ हद तक कम किया जा सकता है, फिर भी यह एक महत्वपूर्ण विचार है। यहां, लेगिनन सॉफ्टवेयर सूट (एक स्वचालित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके झुके हुए डेटा संग्रह के लिए एक सरल-से-कार्यान्वित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो खुली पहुंच उपलब्ध है और माइक्रोस्कोप 11,12,13,14 की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है। इस विधि के लिए कम से कम संस्करण 3.0 या उच्चतर की आवश्यकता होती है, जिसमें 3.3 से आगे झुके हुए डेटा संग्रह को सक्षम करने के लिए समर्पित सुधार होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए कोई अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर या उपकरण आवश्यक नहीं है। कम्प्यूटेशनल बुनियादी ढांचे और स्थापना गाइड पर व्यापक निर्देश कहीं और प्रदान किएजाते हैं।

Protocol

1. नमूना तैयार करना सोने की पन्नी और गोल्ड ग्रिड समर्थन16 ( सामग्री की तालिका देखें) वाले ग्रिड का उपयोग करें क्योंकि झुका हुआ डेटा संग्रह बीम-प्रेरित गति17 को बढ़ा सकता ह?…

Representative Results

0.3 मिलीग्राम / एमएल पर डीपीएस का उपयोग 0 ° , 30 ° और 60 ° झुकाव पर इमेजिंग प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। विभिन्न झुकाव कोणों से डेटा विभिन्न ग्रिड क्षेत्रों में एक ही ग्रिड पर एकत्र किया गया था। सीटीएफ रिज़?…

Discussion

वायु-जल इंटरफ़ेस के नमूना पालन के कारण पसंदीदा कण अभिविन्यास क्रायो-ईएम एसपीए 4,5,6 का उपयोग करके नियमित उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए अंतिम प्रमुख बाधाओं म…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम माइक्रोस्कोपी, लेगिनन इंस्टॉलेशन और डेटा ट्रांसफर इंफ्रास्ट्रक्चर के साथ मदद के लिए बिल एंडरसन, चार्ल्स बोमन और जीन-क्रिस्टोफ़ डुकॉम (टीएसआरआई) को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन के लिए गॉर्डन लुई (साल्क इंस्टीट्यूट) और योंग ज़ी टैन (नेशनल यूनिवर्सिटी ऑफ सिंगापुर) को भी धन्यवाद देते हैं। हम डीपीएस की अभिव्यक्ति के लिए प्लास्मिड प्रदान करने के लिए क्रिस रूसो (एमआरसी लेबोरेटरी ऑफ मॉलिक्यूलर बायोलॉजी, कैम्ब्रिज) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (U54AI150472, U54 AI170855, और R01AI136680 से डीएल), नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF MCB-2048095 से डीएल), हर्स्ट फाउंडेशन (डीएल को), और आर्थर और जूली वुडरो चेयर (J.P.N.) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01
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Cryo-EMSingle-particle AnalysisStage TiltParticle OrientationData CollectionEucentric HeightImage ShiftFocusHole FindingAutomated Targeting

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Citer Cet Article
Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).
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