Single-Particle Cryo-EM-datainsamling med steglutning med Leginon

Summary

Detta protokoll beskriver ett generaliserat och lättimplementerat schema för insamling av lutade enpartikeldata i kryo-EM-experiment. Ett sådant förfarande är särskilt användbart för att erhålla en högkvalitativ EM-karta för prover som lider av preferensorienteringsbias på grund av vidhäftning till luft-vattengränssnittet.

Abstract

Enpartikelanalys (SPA) med kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) är nu en vanlig teknik för högupplöst strukturbiologi. Strukturbestämning av SPA bygger på att erhålla flera distinkta vyer av ett makromolekylärt objekt förglasat i ett tunt islager. Idealt sett skulle en samling likformigt fördelade slumpmässiga projektionsorienteringar uppgå till alla möjliga vyer av objektet, vilket ger upphov till rekonstruktioner som kännetecknas av isotrop riktningsupplösning. Men i verkligheten lider många prover av företrädesvis orienterade partiklar som fäster vid luft-vattengränssnittet. Detta leder till ojämna vinkelorienteringsfördelningar i datasetet och inhomogen Fourier-rumssampling i rekonstruktionen, vilket översätts till kartor som kännetecknas av anisotrop upplösning. Att luta provstadiet ger en generaliserbar lösning för att övervinna upplösningsanisotropi genom att förbättra enhetligheten i orienteringsfördelningarna och därmed isotropin för Fourierrumsprovtagning. Detta protokoll beskriver en automatiserad datainsamlingsstrategi i lutningssteg med hjälp av Leginon, en programvara för automatiserad bildinsamling. Proceduren är enkel att implementera, kräver ingen extra utrustning eller programvara och är kompatibel med de flesta standardtransmissionselektronmikroskop (TEM) som används för avbildning av biologiska makromolekyler.

Introduction

Tillkomsten av direkta elektrondetektorer under det senaste decenniet ^1,2,3 har stimulerat en exponentiell ökning av antalet högupplösta strukturer av makromolekyler och makromolekylära sammansättningar lösta med hjälp av kryo-EM ^4,5,6 med en partikel. Nästan alla renade makromolekylära arter förväntas vara mottagliga för strukturbestämning med kryo-EM, förutom de minsta proteinerna ~ 10 kDa i storlek eller under⁷. Mängden utgångsmaterial som behövs för preparering av nät och strukturbestämning är minst en storleksordning mindre än andra tekniker för strukturbestämning, såsom kärnmagnetisk resonansspektroskopi och röntgenkristallografi ^4,5,6.

En huvudutmaning för strukturbestämning med kryo-EM innebär dock lämplig nätberedning för avbildning. En omfattande studie som utvärderade olika prover med olika förglasningsstrategier och galler föreslog att de flesta metoder för förglasning av prover på kryo-EM-galler leder till preferensvidhäftning av makromolekyler till luft-vattengränssnittet⁸. Sådan vidhäftning kan potentiellt orsaka fyra suboptimala resultat: (1) det makromolekylära provet denaturerar fullständigt, i vilket fall ingen framgångsrik datainsamling och bearbetning är möjlig; (2) provet denatureras delvis, i vilket fall det kan vara möjligt att erhålla strukturella insikter från regioner av makromolekylen som inte är skadade; (3) provet behåller den ursprungliga strukturen, men endast en uppsättning partikelorienteringar i förhållande till elektronstrålens riktning representeras i bilderna; (4) provet behåller sin ursprungliga struktur, och vissa men inte alla möjliga partikelorienteringar i förhållande till elektronstrålens riktning representeras i bilderna. För fall (3) och (4) hjälper lutad datainsamling till att minimera riktningsupplösningsanisotropi som påverkar den rekonstruerade kryo-EM-kartan och ger en generaliserbar lösning för en mängd olika prover⁹. Tekniskt sett kan lutning också gynna fall (2), eftersom denatureringen förmodligen sker vid luft-vattengränssnittet och på samma sätt begränsar antalet distinkta orienteringar som representeras i data. Omfattningen av orienteringsbias i datauppsättningen kan potentiellt ändras genom att experimentera med lösningstillsatser, men brist på bred tillämplighet hindrar dessa trial-and-error-metoder. Att luta provsteget i en enda optimerad lutningsvinkel är tillräckligt för att förbättra orienteringsfördelningen genom att ändra geometrin för avbildningsexperimentet⁹ (figur 1). På grund av den geometriska konfigurationen av det företrädesvis orienterade provet med avseende på elektronstrålen, för varje kluster av preferensorienteringar, genererar lutning av gallret en kon av belysningsvinklar med avseende på klustercentroiden. Därför sprider detta ut vyerna och förbättrar följaktligen Fourier-rymdprovtagning och isotropin för riktningsupplösning.

Det finns i praktiken vissa nackdelar med att luta scenen. Om du lutar provsteget införs en fokusgradient över synfältet, vilket kan påverka noggrannheten i uppskattningarna av kontrastöverföringsfunktionen (CTF). Insamling av lutande data kan också leda till ökad strålinducerad partikelrörelse orsakad av ökade laddningseffekter vid avbildning av lutande prover. Rutnätslutning leder också till en ökning av den uppenbara istjockleken, vilket i sin tur leder till bullrigare mikrografier och kan i slutändan påverka upplösningen av rekonstruktioner 5,9,10. Det kan vara möjligt att övervinna dessa problem genom att tillämpa avancerade beräkningsdatabehandlingsscheman som beskrivs kortfattat i protokoll- och diskussionsavsnitten. Slutligen kan lutning leda till ökad partikelöverlappning, vilket hindrar den efterföljande bildbehandlingsrörledningen. Även om detta kan mildras till viss del genom att optimera partikelkoncentrationen på nätet, är det ändå ett viktigt övervägande. Här beskrivs ett protokoll som är enkelt att implementera för lutande datainsamling med hjälp av Leginon mjukvarusvit (en automatiserad bildinsamlingsprogramvara), tillgänglig öppen åtkomst och kompatibel med ett brett spektrum av mikroskop^11,12,13,14. Metoden kräver minst version 3.0 eller senare, med version 3.3 och framåt som innehåller dedikerade förbättringar för att möjliggöra lutande datainsamling. Ingen ytterligare programvara eller utrustning behövs för detta protokoll. Omfattande instruktioner om beräkningsinfrastruktur och installationsguider finns på annan plats¹⁵.

Protocol

1. Beredning av prov Använd rutnät som innehåller guldfolie och guldgallerstöd16 (se materialtabell) eftersom lutande datainsamling kan accentuera strålinducerad rörelse17.OBS: För den aktuella studien förglasades prover på galler med manuell dopp- och blottningsteknik18 i ett fuktat (mer än 80%) kylrum (~ 4 ° C). Undvik att använda galler som innehåller kopparstöd och kolfolie e…

Representative Results

DPS vid 0,3 mg/ml användes för att demonstrera avbildning vid 0°, 30° och 60° lutningar. Data från olika lutningsvinklar samlades in på samma rutnät i olika rutnätsregioner. CTF-upplösningen passar för högre vinkellutningar tenderar att vara sämre, vilket var fallet vid jämförelse av de tre dataseten i denna studie. Figur 4 visar jämförande representativa bilder och 2D-klassificeringsmedelvärden. Även om proteinkoncentrationen är oförändrad över de olika lutningsvinkla…

Discussion

Föredragen partikelorientering orsakad av provets vidhäftning till luft-vattengränssnittet är en av de sista stora flaskhalsarna för rutinmässig högupplöst strukturbestämning med kryo-EM SPA ^4,5,6. Datainsamlingsschemat som presenteras här ger en lättimplementerad strategi för att förbättra orienteringsfördelningen av partiklar inom ett dataset. Vi noterar att protokollet inte kräver någon extra utrustning eller…

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01