הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי
Summary
הפרוטוקול המוצג מתאר את הפיתוח והשימוש בטכניקת צביעת אקטין נימה מבוססת פלואידין עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) כדי להמחיש את מבנה שכבת התא הדבק בתעלות תרבית דינמיות מיקרופלואידיות ובתאי תרבית סטטיים קבועים מסורתיים. גישה זו מסייעת בהערכת מפגש שכבות התא, היווצרות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה.
Abstract
ניסויים מיקרופלואידים במבחנה טומנים בחובם פוטנציאל רב לחשוף תובנות רבות על תופעות מיקרופיזיולוגיות המתרחשות במצבים כגון תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופגיעה ריאתית הנגרמת על ידי הנשמה (VILI). עם זאת, מחקרים בתעלות מיקרופלואידיות בעלות ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים של הריאה האנושית עומדים כיום בפני מספר אתגרים, במיוחד בשל קשיים בקביעת תנאי תרבית תאים מתאימים, כולל קצב זרימת מדיה, בסביבת תרבית נתונה. הפרוטוקול המוצג מתאר גישה מבוססת תמונה להערכת המבנה של תאי אפיתל ריאה אנושיים NCI-H441 בתרבית בתעלה מיקרופלואידית אטומה לחמצן עם ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים של הריאה האנושית. באמצעות צביעת אקטין נימה מבוססת פלואדין, מבני השלד הציטו-שלד של התאים נחשפים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, המאפשר הדמיה של תאים בודדים כמו גם שכבות. כימות לאחר מכן קובע אם תנאי תרבית התאים המופעלים מייצרים מונושכבות אחידות המתאימות לניסויים נוספים. הפרוטוקול מתאר תרביות תאים ושיטות הערכת שכבות בתעלות מיקרופלואידיות ובסביבות מסורתיות של באר קבועה. זה כולל בניית תעלות, תרבית תאים ותנאים נדרשים, קיבוע, חלחול וצביעה, הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית, עיבוד תמונה וניתוח נתונים.
Introduction
תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא מצב חריף הנובע מעלבון והתפשטות של פגיעה בפרנכימת הריאות, וכתוצאה מכך בצקת ריאות של הנאדיות, חילופי גזים לקויים, והיפוקסמיה, לאחר מכן היפוקסמיה1. זה מתחיל מחזור של שחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים, גיוס נויטרופילים, שחרור מתווך רעיל ונזק לרקמות, אשר עצמו גורר תגובה דלקתית נוספת2. בנוסף, פעילי שטח ריאתיים, אשר מייצבים את דרכי הנשימה ומונעים נזק הנגרם על ידי גיוס/גיוס חוזר (R/D), עלול להיות מושבת או להפוך לבלתי מתפקד בדרך אחרת על ידי תהליכים כימיים המתרחשים במהלך ARDS, וכתוצאה מכך מתח נוסף ופגיעה בפרנכימה3 שמסביב. אם נגרם נזק מספיק, ייתכן שיהיה צורך באוורור מכני כדי להבטיח חמצון מערכתי נאות4. עם זאת, אוורור מכני מטיל אתגרים וטראומות משלו, כולל האפשרות של פגיעה ריאתית כתוצאה מהנשמה (VILI), המאופיינת כפגיעה בפרנכימת הריאה הנגרמת על ידי לחצים מכניים המופעלים במהלך ניפוח יתר (וולוטראומה) ו / או R/D של ממשק אוויר-נוזל בנתיב האוויר החסום בנוזל (atelectrauma)5. שיפוע הלחץ שחווים תאי אפיתל החשופים לממשק אוויר-נוזל (כמו בסימפונות חבויים בנוזל) במודל האטלקטטראומה יכול לגרום לתגובה חסימתית שמקורה בחדירות (POOR), מה שמוביל למעגל מוסרי של פציעה 6,7,8.
ניסויים במבחנה יכולים לספק תובנות בקנה מידה מיקרוני על תופעות אלה, אך מחקרים עכשוויים בסביבות תעלות מיקרופלואידיות עם ממדים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עומדים בפני מספר אתגרים9. ראשית, אופטימיזציה של תנאי תרביות תאים מהווה חסם כניסה משמעותי למחקר תרביות תאים בסביבות מיקרופלואידיות, שכן קיים צומת צר שבתוכו פרמטרים של זרימת מדיה, משך תרבית ותנאי תרבית אחרים מאפשרים היווצרות אופטימלית של שכבת התא. זה כולל את מגבלות הדיפוזיה המוטלות על ידי הטבע הבלתי חדיר לחמצן של מארז תעלת התרבית המיקרופלואידית. זה מחייב התחשבות זהירה בפרמטרים של זרימת מדיה, שכן קצבי זרימה נמוכים יכולים למנוע מהתאים חמצן, במיוחד אלה הרחוקים ביותר מהמפרצון; מצד שני, קצבי זרימה גבוהים יכולים לדחוף תאים אל מחוץ לתעלת התרבית או לגרום להתפתחות שכבה לא תקינה או לא אחידה. ניתן לטפל במגבלות הדיפוזיה על ידי שימוש בחומרים חדירים לחמצן כגון פולידימתילסילוקסאן (PDMS) במנגנון תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI); עם זאת, תעלות תרבית מיקרופלואידיות קונבנציונליות רבות, כגון אלה של מערכת חישת עכבת המצע החשמלי של התא (ECIS), הן מטבען אטומות לחמצן, בהתחשב בטבעו של המארז המיוצר10. פרוטוקול זה נועד לספק טכניקה לניתוח שכבות תאים בתרבית במארז אטום לחמצן.
כאשר משווים את הכדאיות של תנאי תרבית, יש צורך בתצפיות של מאפייני שכבה ספציפיים, כגון נוכחות של חד-שכבתיות, טופולוגיית פני שטח, מפגש ואחידות בעובי שכבה, כדי לקבוע אם שכבת התא המיוצרת על ידי קבוצה מסוימת של תנאי תרבית עומדת במפרט הרצוי ואכן רלוונטית לתכנון הניסוי. הערכה מוגבלת יכולה להתבצע בשיטות כגון ECIS, המשתמשת במדידות של פוטנציאל חשמלי (מתח) שנוצר על ידי התנגדות לזרם חילופין בתדר גבוה (AC) (עכבה) המוטלת על ידי ממברנות מבודדות חשמלית של תאים בתרבית על אלקטרודות זהב בתוך מערך הזרימה. על ידי אפנון התדר של AC המופעל על תאים, תכונות תאיות תלויות תדר ספציפיות של התאים ושכבות התא כגון חוזק היצמדות פני השטח, היווצרות צומת הדוק, והתפשטות תאים או מפגש תאים עשויות להיות ממוקדות ונבדקות11. עם זאת, צורות עקיפות אלה של מדידות הן קצת קשה לפרש בתחילת הניסוי, ולא יכול לכמת את כל ההיבטים הרלוונטיים של שכבת התא. התבוננות פשוטה בשכבת התא תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עשויה לחשוף את טבען של תכונות מסוימות כגון מפגש; עם זאת, מאפיינים רלוונטיים רבים כגון נוכחות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה דורשים הערכה תלת-ממדית (תלת-ממדית) שאינה אפשרית עם הדמיה מיקרוסקופית של שדה בהיר, ניגודיות פאזה או פלואורסצנטית12.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח טכניקת צביעת אקטין נימה שתאפשר אימות מבוסס הדמיה של שכבה חד-שכבתית והערכת אחידות שכבת התא באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). Filamentous-actin (F-actin) נחשב למטרה מתאימה לצמידות פלואורופור, בין השאר בשל האופן שבו F-actin עוקב בחוזקה אחר קרום התא, מה שמאפשר קירוב חזותי של נפח התא כולו13. יתרון חשוב נוסף של מיקוד F-actin הוא האופן שבו צביעה של F-actin מבהירה חזותית הפרעות בשלד או שינויים המוטלים על ידי לחצים וזנים שחווים התאים. קיבוע צולב עם פורמלדהיד נטול מתנול שימש לשימור המורפולוגיה של התאים ושכבת התא, שכן קיבועים מייבשים כגון מתנול נוטים לשטח תאים, לעוות באופן גס את שכבת התא ולשנות את תכונותיה14,15.
כדי לקבוע את יכולתה של טכניקת הערכת השכבות למתן אתגרים אלה, תאים גודלו בתרבית בתאי תרבית מסורתיים של שמונה בארות, כמו גם בתעלות מיקרופלואידיות כדי להעריך את ההבדלים, אם בכלל, בשכבות התא שנוצרו. עבור בארות תרבות קבועות, יחידות כיסוי שמונה בארות שימש יחידות כיסוי קימור. עבור תרבית מיקרופלואידית, מערכי זרימה (אורך תעלה 50 מ”מ, רוחב 5 מ”מ, עומק 0.6 מ”מ) הותאמו לתאי אפיתל ריאה אנושיים מונצחים (NCI-H441) בסביבה עם ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים הנמצאים באזור הנשימה של הריאה האנושית16. בעוד פרוטוקול זה פותח תוך התחשבות בסביבת התרבית של מערכי זרימת ECIS, הוא עשוי לחול על כל סביבה דינמית-תרבית אטומה לחמצן שעבורה נדרשת הערכה של מאפייני שכבת התא בתרבית או תנאי תרבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר את התרבית, קיבוע הצלבה, צביעה, חלחול והדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית של תאי אפיתל ריאה אנושיים NCI-H441 בסביבה הדינמית של מערך זרימה מיקרופלואידית חד-ערוצית, כמו גם בסביבה הסטטית של זכוכית כיסוי מסורתית בעלת שמונה תאים. עם כל פרוטוקול תרבית תאים מיקרופלואידית, תנאי הזרימה ש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לאלן שפרדסון על תכנון תבנית החיתוך עבור דבק 3M ויריעת מיילר המשמשת לבניית תעלות מיקרופלואידיות ועל בדיקת קצב זרימת המדיה של תרבית התא ותכנות משאבת המזרק. המימון סופק על ידי NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801, ומענק הדיקן של מכללת ניוקומב-טוליין.
Materials
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. . The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022)
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
