Forberedelse og strukturel evaluering af epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning
Summary
Den præsenterede protokol beskriver udviklingen og anvendelsen af en phalloidin-baseret filamentøs actinfarvningsteknik med konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) til visualisering af klæbende cellelagstruktur i mikrofluidiske dynamiske kulturkanaler og traditionelle statiske kulturkamre med fast brønd. Denne tilgang hjælper med at evaluere cellelagssammenløb, monolagsdannelse og lagtykkelsesensartethed.
Abstract
In vitro mikrofluidiske eksperimenter har stort potentiale til at afsløre mange indsigter i de mikrofysiologiske fænomener, der forekommer under tilstande som akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) og respirator-induceret lungeskade (VILI). Imidlertid står undersøgelser i mikrofluidiske kanaler med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge, i øjeblikket over for flere udfordringer, især på grund af vanskeligheder med at etablere passende cellekulturbetingelser, herunder mediestrømningshastigheder, inden for et givet dyrkningsmiljø. Den præsenterede protokol beskriver en billedbaseret tilgang til evaluering af strukturen af NCI-H441 humane lungeepitelceller dyrket i en iltuigennemtrængelig mikrofluidisk kanal med dimensioner, der fysiologisk er relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge. Ved hjælp af phalloidin-baseret filamentøs actinfarvning afsløres cellernes cytoskeletale strukturer ved konfokal laserscanningsmikroskopi, hvilket muliggør visualisering af individuelle såvel som lagdelte celler. Efterfølgende kvantificering bestemmer, om de anvendte cellekulturbetingelser producerer ensartede monolag, der er egnede til yderligere eksperimentering. Protokollen beskriver cellekultur og lagevalueringsmetoder i mikrofluidiske kanaler og traditionelle miljøer med fast brønd. Dette inkluderer kanalkonstruktion, cellekultur og nødvendige betingelser, fiksering, permeabilisering og farvning, konfokal mikroskopisk billeddannelse, billedbehandling og dataanalyse.
Introduction
Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en akut tilstand som følge af fornærmelse mod og udbredelse af skade i lungeparenchymen, hvilket resulterer i lungeødem i alveolerne, utilstrækkelig gasudveksling og efterfølgende hypoxæmi1. Dette initierer en cyklus af proinflammatorisk cytokinfrigivelse, neutrofilrekruttering, toksisk mediatorfrigivelse og vævsskade, som i sig selv medfører et yderligere inflammatorisk respons2. Derudover kan lungeoverfladeaktivt stof, som stabiliserer luftvejene og forhindrer skader forårsaget af gentagen rekruttering / derekruttering (R / D), inaktiveres eller på anden måde gøres dysfunktionel af de kemiske processer, der forekommer under ARDS, hvilket resulterer i yderligere stress og skade på det omgivende parenkym3. Hvis der opstår tilstrækkelig skade, kan mekanisk ventilation være nødvendig for at sikre tilstrækkelig systemisk iltning4. Imidlertid pålægger mekanisk ventilation sine egne udfordringer og traumer, herunder muligheden for respiratorinduceret lungeskade (VILI), karakteriseret som skade på lungeparenkymet forårsaget af de mekaniske belastninger, der pålægges under overinflation (volutrauma) og / eller R / D af luft-væskegrænsefladen i de væske-okkluderede luftveje (atelectrauma)5. Trykgradienten, der opleves af epitelceller udsat for en luft-væske-grænseflade (som i en væske-okkluderet bronchiole) i atelectrauma-modellen, kan resultere i et permeabilitetsopstået obstruktivt respons (POOR), hvilket fører til en POOR-get-POORer dydigskadecyklus 6,7,8.
In vitro-eksperimenter kan give mikroskala indsigt i disse fænomener, men aktuelle undersøgelser i mikrofluidiske kanalmiljøer med fysiologisk relevante dimensioner står over for flere udfordringer9. For det første udgør optimering af cellekulturbetingelser en betydelig adgangsbarriere for cellekulturforskning i mikrofluidiske miljøer, da der findes et smalt skæringspunkt, inden for hvilket mediestrømningsparametre, dyrkningsvarighed og andre kulturbetingelser tillader optimal dannelse af cellelag. Dette omfatter de diffusionsbegrænsninger, der er pålagt af den iltuigennemtrængelige karakter af den mikrofluidiske kulturkanalindeslutning. Dette kræver nøje overvejelse af mediestrømningsparametre, da lave strømningshastigheder kan fratage celler ilt, især dem, der er længst væk fra indløbet; På den anden side kan høje strømningshastigheder skubbe celler ud af kulturkanalen eller resultere i forkert eller ujævn lagudvikling. Diffusionsbegrænsninger kan afhjælpes ved at anvende oxygengennemtrængelige materialer såsom polydimethylsiloxan (PDMS) i et luft-væske-interface (ALI)-kulturapparat Mange konventionelle mikrofluidiske kulturkanaler, f.eks. kanalerne i ECIS-systemet (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing), er imidlertid i sagens natur iltuigennemtrængelige på grund af arten af det fremstillede kabinet10. Denne protokol sigter mod at tilvejebringe en teknik til analyse af cellelag dyrket i et iltuigennemtrængeligt kabinet.
Ved sammenligning af levedygtigheden af dyrkningsbetingelser er observationer af specifikke lagegenskaber, såsom tilstedeværelsen af et monolag, overfladetopologi, sammenløb og lagtykkelsesensartethed, nødvendige for at bestemme, om cellelaget produceret af et bestemt sæt kulturbetingelser opfylder de ønskede specifikationer og faktisk er relevante for det eksperimentelle design. En begrænset evaluering kan udføres ved metoder som ECIS, der anvender målinger af elektrisk potentiale (spænding) skabt af modstand mod højfrekvent vekselstrøm (AC) (impedans) pålagt af elektrisk isolerende membraner af celler dyrket på guldelektroder i flowarrayet. Ved at modulere frekvensen af AC anvendt på celler kan specifikke frekvensafhængige cellulære egenskaber af cellerne og cellelagene, såsom overfladevedhæftningsstyrke, tæt forbindelsesdannelse og celleproliferation eller sammenløb, målrettes og undersøges11. Disse indirekte former for målinger er imidlertid noget vanskelige at fortolke ved begyndelsen af et eksperiment og kvantificerer muligvis ikke alle relevante aspekter af cellelaget. Blot at observere cellelaget under et fasekontrastmikroskop kan afsløre arten af visse kvaliteter såsom sammenløb; Mange relevante egenskaber såsom tilstedeværelsen af et monolag og lagtykkelsens ensartethed kræver imidlertid en tredimensionel (3D) evaluering, som ikke er mulig med brightfield, fasekontrast eller fluorescerende mikroskopisk billeddannelse12.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en filamentøs actinfarvningsteknik for at muliggøre billeddannelsesbaseret verifikation af et monolag og evaluering af cellelagets ensartethed ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM). Filamentøs actin (F-actin) blev anset for et passende mål for fluoroforkonjugatet, delvis på grund af den måde, hvorpå F-actin tæt følger cellemembranen, hvilket muliggør en visuel tilnærmelse af hele cellevolumen13. En anden vigtig fordel ved målretning af F-actin er den måde, hvorpå farvning af F-actin visuelt belyser cytoskeletale forstyrrelser eller ændringer pålagt af de belastninger og belastninger, som cellerne oplever. Tværbindingsfiksering med methanolfri formaldehyd blev brugt til at bevare cellernes og cellelagets morfologi, da dehydrerende fikseringsmidler såsom methanol har tendens til at flade celler, groft forvrænge cellelaget og ændre dets egenskaber14,15.
For at bestemme lagevalueringsteknikkens evne til at afbøde disse udfordringer blev celler dyrket i traditionelle kulturkamre med otte brønde såvel som i mikrofluidiske kanaler for at evaluere forskellene, hvis nogen, i de cellelag, der blev produceret. Til faste kulturbrønde blev der anvendt otte-brøndkammerede dækglasenheder. Til mikrofluidisk kultur blev flowarrays (kanallængde 50 mm, bredde 5 mm, dybde 0,6 mm) optimeret til dyrkning af udødeliggjorte humane lungeepitelceller (NCI-H441) i et miljø med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler, der er til stede i åndedrætszonen i den menneskelige lunge16. Selvom denne protokol blev udviklet med kulturmiljøet i ECIS-flowarrays i tankerne, kan den gælde for ethvert iltuigennemtrængeligt dynamisk kulturmiljø, for hvilket evaluering af dyrkede cellelagskarakteristika eller kulturbetingelser er nødvendig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver kulturen, tværbindingsfiksering, farvning, permeabilisering og konfokal mikroskopisk visualisering af NCI-H441 humane lungeepitelceller i det dynamiske miljø i et enkeltkanals mikrofluidisk flowarray såvel som i det statiske miljø i et traditionelt otte-brøndkammerdækglas. Med enhver mikrofluidisk cellekulturprotokol er strømningsbetingelserne for cellekulturmediet af afgørende betydning, da den høje hastighed har potentialet til at vaske cellerne væk eller forstyrre den nor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Alan Shepardson for at designe skæremønsteret til 3M-klæbemidlet og mylararket, der anvendes i mikrofluidisk kanalkonstruktion og til test af cellekulturmediestrømningshastigheden og sprøjtepumpeprogrammeringen. Finansiering blev leveret af NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 og Newcomb-Tulane College Dean’s Grant.
Materials
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. . The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022)
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
