वर्तमान प्रोटोकॉल में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 और दाता डीएनए के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन का वर्णन किया गया है।
CRISPR-Cas तकनीक ने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की तेजी से और सहज पीढ़ी को सक्षम किया है। विशेष रूप से, चूहों और बिंदु उत्परिवर्ती चूहों को युग्मनज में सीआरआईएसपीआर कारकों (और एकल-फंसे हुए ऑलिगो डीएनए दाताओं) के इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा आसानी से उत्पादित किया जाता है। इसके विपरीत, जीन कैसेट (>1 केबी) नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहे मुख्य रूप से सीआरआईएसपीआर कारकों और डबल-फंसे डीएनए दाताओं के युग्मकों के माइक्रोइंजेक्शन द्वारा उत्पन्न होते हैं। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उत्पादन के लचीलेपन में भी वृद्धि की है। अब लक्षित जीनोमिक क्षेत्रों में लक्षित उत्परिवर्तन को कई फायदेमंद इनब्रेड माउस उपभेदों में पेश करना संभव है। हमारी टीम ने जापान सहित कई देशों के अनुरोधों के बाद सीआरआईएसपीआर-कैस 9 के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा 200 से अधिक जीन कैसेट नॉक-इन माउस लाइनों और 110 से अधिक फ्लोक्स्ड माउस लाइनों का उत्पादन किया है। इनमें से कुछ जीनोम संपादन में बीएएलबी /सी, सी 3 एच / एचईजे, और सी 57 बीएल / 6 एन इनब्रेड उपभेदों का उपयोग किया गया था, हालांकि अधिकांश ने सी 57 बीएल / 6 जे का उपयोग किया। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि के विपरीत, चूहों के विभिन्न इनब्रेड उपभेदों में युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा जीनोम संपादन इतना आसान नहीं है। हालांकि, एकल इनब्रेड आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहे आनुवंशिक मानवीकृत, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और सशर्त नॉकआउट माउस मॉडल के रूप में महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, यह लेख जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों को उत्पन्न करने के लिए सी 57बीएल / 6 जे चूहों में सीआरआईएसपीआर कारकों और डबल-फंसे डीएनए दाताओं के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह लेख विशेष रूप से साइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के बजाय परमाणु इंजेक्शन पर केंद्रित है। युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के अलावा, हम उत्पादन प्रक्रिया और परिधीय तकनीकों जैसे सुपरोव्यूलेशन और भ्रूण हस्तांतरण के प्रेरण के लिए समयरेखा की रूपरेखा तैयार करते हैं।
नॉक-इन चूहों, जिसमें लक्षित लोकी पर इच्छित बहिर्जात जीन पेश किए जाते हैं, विवो अध्ययनों में जीन मानवीकृत चूहों, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों और क्रे ड्राइवर चूहों1,2 के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। जब माउस युग्मकों में जीनोम संपादन द्वारा नॉक-इन उत्परिवर्तन प्रेरित होते हैं, तो एकल-फंसे हुए डीएनए (एकल-फंसे हुए ऑलिगो डीएनए दाता, एसएसओडीएन) या डबल-फंसे हुए डीएनए (डीएसडीएनए) का उपयोग दाता डीएनए 2,3 के रूप में किया जाता है। एसएसओडीएन का उपयोग मुख्य रूप से 200 बीपी 4 से कम के अपेक्षाकृत छोटे जीन टुकड़ों को खटखटाने के लिए किया जाताहै। लंबे एसएसओडीएन (एलएसओडीएन) 5,6 का उपयोग करके 1 केबी डीएनए से अधिक लंबे टुकड़ों को खटखटाना संभव है, हालांकि उनकी तैयारी समय लेने वाली है। जब डीएसडीएनए दाताओं का उपयोग किया जाता है, तो जीन कैसेट (>1 केबी) नॉक-इन चूहों को श्रमसाध्य दाता डीएनए तैयारी के बिना उत्पन्न किया जा सकताहै।
एसएसओडीएन का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि इलेक्ट्रोपोरेशन8 नॉक-इन चूहों को उत्पन्न कर सकता है। हालांकि, डीएसडीएनए दाताओं को युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा सीधे नाभिक में पेश किया जाना चाहिए। फ्लोक्स्ड चूहों को बनाने के लिए दो साइटों पर एक साथ नॉक-इन की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रत्येक लॉक्सपी अनुक्रम को लक्ष्य जीन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में खटखटाया जाता है। माउस युग्मकों में जीनोम संपादन द्वारा फ्लोक्स्ड चूहों को उत्पन्न करने के दो तरीके हैं- दो स्वतंत्र एसएसओडीएन का उपयोग करके, प्रत्येक में एक एकल लॉक्सपी साइट होती है, या फ्लोक्स्ड अनुक्रम के साथ एकल डीएसडीएनए (या एलएसडीएनए) का उपयोग किया जाता है; पूर्व बहुत अक्षम 9,10,11 है। डीएसडीएनए दाताओं का उपयोग करके जीनोम संपादन जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का उत्पादन करने का सबसे सरल तरीका है यदि वातावरण युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के लिए अनुकूल है।
प्रारंभ में, कैस 9 एमआरएनए और एसजीआरएनए या डीएनए वैक्टर एन्कोडिंग एसजीआरएनए और कैस 9 के मिश्रण का उपयोग माउस युग्मकों12,13 में जीनोम संपादन के लिए किया जाता है। चूंकि उच्च गुणवत्ता वाले और स्थिर कैस 9 प्रोटीन अब कम लागत पर उपलब्ध हैं, माउस युग्मकों14 में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) की शुरूआत लोकप्रिय हो गई है। हाल ही में, नॉक-इन चूहों को एक सेल चक्र चरण में माउस युग्मकों के दोनों प्रोन्यूक्लियस में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 आरएनपी और दाता डीएनए पेश करके उच्च दक्षता के साथउत्पन्न किया गया है, जहां नॉक-इन होने की सबसे अधिक संभावना है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल इस विधि द्वारा विभिन्न प्रकार के नॉक-इन चूहों के उत्पादन के लिए तकनीकों का वर्णन करता है।
प्रयोगशाला चूहों के कई उपयोगी इनब्रेड उपभेद हैं। इनब्रेड पृष्ठभूमि के भीतर आनुवंशिक संशोधन फेनोटाइप पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव की उपेक्षा कर सकता है। यह लेख सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले इनब्रेड माउस लाइन, सी 57बीएल / 6 जे17 के युग्मनज में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड म्यूटेशन को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की पीढ़ी और उपयोग की जाने वाली परिधीय तकनीकों की समयरेखा पर भी चर्चा की जाती है, जिसमें सुपरोव्यूलेशन और भ्रूण हस्तांतरण का प्रेरण शामिल है।
वर्तमान अध्ययन में, प्राकृतिक संभोग से प्राप्त ताजा (जमे हुए-पिघले हुए नहीं) सी 57बीएल / 6 जे माउस युग्मकों का उपयोग जीनोम संपादन माउस उत्पादन के लिए किया गया था। सेल चक्र चरण में इन युग्मकों के दोनों प्रोन्यूक्लियस में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 और दाता डीएनए (आरएनपीडी) को इंजेक्ट करके, जहां नॉक-इन होने की सबसे अधिक संभावना है, जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों को उच्च जन्म दर और पर्याप्त जीनोम संपादन दक्षता के साथ उत्पन्न किया गया था। वर्तमान अध्ययन स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि15 की विस्तारशीलता को मजबूत करता है, जहां यह सी 57बीएल / 6 जे आनुवंशिक पृष्ठभूमि में भी पर्याप्त नॉक-इन दक्षता सुनिश्चित करता है, और फ्लोक्स्ड चूहों के उत्पादन पर लागू किया जा सकता है।
प्रायोगिक उपकरणों की कम लागत और तकनीक सीखने में आसानी के कारण इलेक्ट्रोपोरेशन जीनोम-संपादित चूहों के उत्पादन की एक अत्यधिक सामान्यीकृत विधिहै। इसके अलावा, आई-गोनाड विधि19, जिसमें ओवीडक्ट में मौजूद प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के साथ जीनोम संपादन किया जाता है, को प्राप्तकर्ता माउस की आवश्यकता नहीं होती है। इन विधियों की तुलना में, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों के संदर्भ में प्रयोगात्मक वातावरण तैयार करते समय यहां प्रस्तुत वर्तमान विधि महंगी और समय लेने वाली है। हालांकि, एक बार प्रयोगात्मक सुविधाएं स्थापित होने के बाद, जटिल जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का उत्पादन केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीआरआईएसपीआर तत्वों (सीआरआरएनए, ट्रैकआरएनए और कैस 9 प्रोटीन) और दाता डीएनए के रूप में उपयोग किए जाने वाले परिपत्र प्लास्मिड वेक्टर की एक सरल, छोटी मात्रा के साथ किया जा सकता है। इसका मतलब यह है कि कई जटिल जीनोम-संपादित माउस लाइनों को तैयार करने के लिए समय लेने वाले (या अपेक्षाकृत महंगे) एलएसओडीएन 5,6 या एडेनो से जुड़े वायरस वैक्टर20 की आवश्यकता के बिना उत्पादित किया जा सकता है।
मूल स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि15 के विपरीत, ताजा (जमे हुए-पिघले हुए) युग्मकों का उपयोग किया गया था। प्राकृतिक संभोग द्वारा ताजा युग्मन प्राप्त करते समय, तकनीकी त्रुटियों को अनदेखा किया जा सकता है जो इन विट्रो निषेचन या ठंड और पिघलने के दौरान हो सकते हैं। इसके अलावा, भ्रूण हेरफेर प्रक्रिया वर्तमान दृष्टिकोण के बाद लगभग आधे दिन (चित्रा 1) में पूरी की जा सकती है। दूसरी ओर, वर्तमान विधि की कुछ सीमाओं में कई नर चूहों की आवश्यकता, निषेचन के समय का ढीला नियंत्रण और माइक्रोइंजेक्शन के लिए युग्मनज की संख्या की पूरी तरह से भविष्यवाणी करने की सीमित क्षमता शामिल है। मूल स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि की तुलना में, इस विधि में उच्च जन्म दर हो सकती है (तालिका 1)। इसके बावजूद, यह निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता है कि प्रयोग कंडक्टर, लक्ष्य जीन, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और भ्रूण की पुष्टि के समय में अंतर के कारण वर्तमान विधि जन्म दर के मामले में बेहतर है।
जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, अधिकांश जीन कैसेट नॉक-इन परियोजनाओं में बड़ी संख्या में चूहों में यादृच्छिक एकीकरण एलील थे। यादृच्छिक एकीकरण को समाप्त किया जाना चाहिए क्योंकि इससे अंतर्जात जीन और ट्रांसजेन की अस्थानिक अभिव्यक्ति का अनपेक्षित विघटन हो सकता है। भविष्य के लिए चुनौती प्रयोगात्मक स्थितियों को ढूंढना है जो पर्याप्त नॉक-इन दक्षता बनाए रखते हुए यादृच्छिक एकीकरण घटनाओं की संख्या को कम करते हैं।
जीनोम एडिटिंग प्रभावकों का उपयोग करके लगभग सभी माउस युग्मनज जीनोम संपादन जिसके परिणामस्वरूप डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक होता है, ऑन-टारगेट साइटों 9,21 पर अनपेक्षित उत्परिवर्तन को प्रेरित करने की संभावना है। इन अनपेक्षित ऑन-टारगेट म्यूटेशन के परिणामों को यहां वर्णित नहीं किया गया है क्योंकि हम ऐसी स्थिति में नहीं हैं जिसमें चूहों की अगली पीढ़ी को उनके स्पष्ट सबूत पेश करने के लिए प्रबंधित किया जा सके। अनपेक्षित ऑन-टारगेट म्यूटेनेसिस के कारण भ्रम की चिंता को दूर करने का सबसे अच्छा तरीका यह है कि संस्थापकों को इंटरक्रॉसिंग करने के बजाय जंगली प्रकार के चूहों के साथ संभोग करके चूहों की अगली पीढ़ी प्राप्त की जाए। सिद्धांत रूप में, इस क्रॉस से उत्पन्न एन 1 चूहे एलील के एक तरफ जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) हैं, इसलिए यदि इच्छित नॉक-इन (केआई) एलील का पता लगाया जाता है, तो वे डब्ल्यूटी / केआई विषमयुग्मी हैं। इसलिए, ऑन-टारगेट म्यूटेनेसिस प्रयोगशाला माउस में एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं है, जिसमें अपेक्षाकृत तेज जीवन चक्र है और एक विपुल जानवर है। हालांकि, जब यह तकनीक अपेक्षाकृत बड़े स्तनधारियों पर लागू होती है तो आगे सुधार आवश्यक होगा।
यह पुष्टि की गई है कि यह तकनीक सी 57बीएल / 6 जे के अलावा अन्य इनब्रेड उपभेदों में जीन कैसेट नॉक-इन चूहों का उत्पादन कर सकती है, लेकिन पर्याप्त संख्या में परियोजनाएं सुरक्षित नहीं हैं, और डेटा अत्यधिक परिवर्तनशील हैं। इस कारण से, यह जानकारी वर्तमान अध्ययन में शामिल नहीं है। यह माना जाता है कि माउस आनुवंशिकी और रोग मॉडल अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए इस विषय पर आगे के अध्ययन आवश्यक होंगे।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (19एच03142: एसएम), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (20एच00444: एफएस), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (21एच04838: एसएम के लिए), और अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान “उन्नत पशु मॉडल समर्थन का मंच” (16एच06276: एसटी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि तैयार करने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। हम जीनोम-संपादन डिजाइन के बारे में उनकी उपयोगी चर्चा के लिए रयोइची मोरी के आभारी हैं।
Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
crRNA | IDT | – | |
Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
hCG | ASKA Animal Health | – | |
Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
Inverted microscope | Leica | ||
KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
Medetomidine | ZENOAQ | – | |
Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
Micromanipulator units | Narishige | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
PMSG | ASKA Animal Health | – | |
Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
RNase | QIAGEN | 19101 | |
RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
tracrRNA | IDT | – |