Den foreliggende protokollen beskriver zygote mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9 og donor DNA for effektivt å produsere genkassett, knock-in og floxed mus.
CRISPR-Cas-teknologien har muliggjort rask og uanstrengt generering av genmodifiserte mus. Spesielt produseres mus og punktmutante mus lett ved elektroporering av CRISPR-faktorer (og enkeltstrengede oligo DNA-donorer) i zygoten. I motsetning til dette genereres genkassett (>1 kb) innslag og floxede mus hovedsakelig ved mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer til zygoter. Genomredigeringsteknologier har også økt fleksibiliteten til genmodifisert musproduksjon. Det er nå mulig å introdusere de tiltenkte mutasjonene i målgenomiske regioner i en rekke gunstige innavlede musestammer. Vårt team har produsert over 200 genkassett knock-in muselinjer, og over 110 floxed muselinjer ved zygote mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9 etter forespørsler fra flere land, inkludert Japan. Noen av disse genomredigeringene brukte BALB/c, C3H/HeJ og C57BL/6N innavlede stammer, men de fleste brukte C57BL/6J. I motsetning til elektroporasjonsmetoden er genomredigering ved zygotemikroinjeksjon i forskjellige innavlede stammer av mus ikke så lett. Imidlertid er genkassett-knock-in og floxed mus på enkelt innavlet genetisk bakgrunn like kritisk som genetisk humanisert, fluorescerende reporter og betingede knockout-musemodeller. Derfor presenterer denne artikkelen protokollen for zygote mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i C57BL/6J-mus for generering av genkassett-innslag og floxede mus. Denne artikkelen fokuserer utelukkende på kjernefysisk injeksjon i stedet for cytoplasmatisk injeksjon. I tillegg til zygote mikroinjeksjon, skisserer vi tidslinjen for produksjonsprosessen og perifere teknikker som induksjon av superovulasjon og embryooverføring.
Knock-in mus, der de tiltenkte eksogene gener blir introdusert ved målet loci, er mye brukt i mange in vivo studier som gen humaniserte mus, fluorescerende reporter mus og Cre driver mus 1,2. Når knock-in mutasjoner induseres av genomredigering i musezygoter, brukes enkeltstrenget DNA (single-stranded oligo DNA donors, ssODN) eller dobbeltstrenget DNA (dsDNA) som donor DNA 2,3. ssODN brukes hovedsakelig til å banke inn relativt korte genfragmenter på mindre enn 200 bp4. Det er mulig å banke inn fragmenter lengre enn 1 kb DNA ved bruk av lange ssODNs (lsODN)5,6, men deres forberedelse er tidkrevende. Når dsDNA-donorer brukes, kan genkassett (>1 kb) innbankede mus genereres uten arbeidskrevende DNA-forberedelse fra donor7.
Hovedfordelen ved å bruke ssODN-er er at elektroporering8 kan generere innslåingsmus. Imidlertid må dsDNA-donorer innføres direkte i kjernen ved zygote mikroinjeksjon. Samtidig innslag på to steder er nødvendig for å skape floxed mus, hvor hver loxP-sekvens blir slått inn oppstrøms og nedstrøms for målgenet. Det er to måter å generere floxed mus ved genomredigering i muszygoter – ved hjelp av to uavhengige ssODNs, hver bærer et enkelt loxP-nettsted, eller bruker et enkelt dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Førstnevnte er svært ineffektiv 9,10,11. Genomredigering ved hjelp av dsDNA-donorer er den enkleste tilnærmingen for å produsere genkassett, innbanking og floxed mus hvis miljøet bidrar til zygote mikroinjeksjon.
I utgangspunktet brukes blandinger av Cas9 mRNA og sgRNA eller DNA-vektorer som koder for sgRNA og Cas9 til genomredigering i musezygoter12,13. Siden høykvalitets og stabile Cas9-proteiner nå er tilgjengelige til en lav pris, har introduksjonen av crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) i muszygoter14 blitt populær. Nylig har knock-in mus blitt generert med høy effektivitet ved å introdusere crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP og donor DNA i begge pronuclei av muszygoter i en cellesyklusfase hvor innbanking er mest sannsynlig å forekomme15. Derfor beskriver denne protokollen teknikker for å produsere ulike typer innslagsmus ved denne metoden.
Det er mange nyttige innavlede stammer av laboratoriemus16. Genetisk modifikasjon innenfor den innavlede bakgrunnen kan se bort fra påvirkning av genetisk bakgrunn på fenotypen. Denne artikkelen beskriver en metode for å indusere genkassettinnslag og floxedmutasjoner i zygoten til den mest brukte innavlede muselinjen, C57BL/6J17. Videre diskuteres også tidslinjen for generering av genetisk modifiserte mus og de perifere teknikkene som brukes, inkludert induksjon av superovulasjon og embryooverføring.
I denne studien ble ferske (ikke frosne-tinte) C57BL/6J musezygoter, oppnådd fra naturlig parring, brukt til genomredigering av museproduksjon. Ved å injisere crRNA-tracrRNA-Cas9 og donor-DNA (RNPD) i begge pronuclei av disse zygotene i en cellesyklusfase hvor innbanking er mest sannsynlig, ble genkassett-innslag og floxed mus generert med høy fødselsrate og tilstrekkelig genomredigeringseffektivitet. Den nåværende studien styrker utvidbarheten til SPRINT-CRISPR-metoden15, der den sikrer tilstrekkelig innslagseffektivitet selv i C57BL/6J genetisk bakgrunn, og kan brukes til produksjon av floxed mus.
Elektroporering er en svært generalisert metode for å produsere genomredigerte mus på grunn av de lave kostnadene ved eksperimentelle enheter og det enkle å lære teknikken8. Videre krever i-GONAD-metoden19, der genomredigering gjøres med preimplantasjonsembryoer som eksisterer i ovidukten, ikke en mottakermus. Sammenlignet med disse metodene er den nåværende metoden som presenteres her kostbar og tidkrevende når man forbereder og vedlikeholder et eksperimentelt miljø når det gjelder både maskinvare og programvare. Men når de eksperimentelle fasilitetene er satt opp, kan komplekse genkassetter og floxed mus produseres med bare kommersielt tilgjengelige CRISPR-elementer (crRNA, tracrRNA og Cas9-protein) og en enkel, liten mengde sirkulær plasmidvektor som skal brukes som donor-DNA. Dette betyr at mange komplekse genomredigerte muselinjer kan produseres uten behov for tidkrevende (eller relativt dyre) lsODN 5,6 eller adeno-assosierte virusvektorer20 for å forberede.
I motsetning til den opprinnelige SPRINT-CRISPR-metoden15 ble det brukt friske (frosne-tinte) zygoter. Når du oppnår friske zygoter ved naturlig parring, kan de tekniske feilene ignoreres som kan oppstå under in vitro befruktning eller frysing og tining. Embryomanipulasjonsprosessen kan også fullføres på omtrent en halv dag (figur 1) etter den nåværende tilnærmingen. På den annen side inkluderer noen begrensninger i den nåværende metoden kravet til mange hannmus, løs kontroll av befruktningstidspunktet og den begrensede evnen til å fullstendig forutsi antall zygoter for mikroinjeksjon. Sammenlignet med den opprinnelige SPRINT-CRISPR-metoden kan denne metoden ha høyere fødselsrate (tab 1). Til tross for dette kan det ikke konkluderes med at den nåværende metoden er bedre når det gjelder fødselsrate på grunn av forskjellene i eksperimentlederne, målgener, genetisk bakgrunn og tidspunktet for embryobekreftelse.
Som vist i tabell 1 hadde et stort antall mus i de fleste genkassettprosjektene tilfeldige integrasjonsalleler. Tilfeldig integrasjon må elimineres fordi det kan føre til utilsiktet forstyrrelse av endogene gener og ektopisk ekspresjon av transgener. Utfordringen for fremtiden er å finne eksperimentelle forhold som reduserer antall tilfeldige integrasjonshendelser samtidig som tilstrekkelig innslagseffektivitet opprettholdes.
Nesten all musezygote genomredigering ved hjelp av genomredigeringseffektorer som resulterer i DNA-dobbeltstrengbrudd, vil sannsynligvis indusere utilsiktede mutasjoner på målsteder 9,21. Resultatene av disse utilsiktede mutasjonene på målet er ikke beskrevet her fordi vi ikke er i en situasjon der neste generasjon mus kan styres for å presentere klare bevis på dem. Den beste måten å utelukke bekymringen for forvirring forårsaket av utilsiktet mutagenese på målet, er å skaffe neste generasjon mus ved å parre grunnleggere med villtypemus i stedet for å krysse grunnleggere. I prinsippet er N1-musene som kommer fra dette krysset villtype (WT) på den ene siden av allelet, så hvis det tiltenkte innslagsallelet (KI) oppdages, er de WT/KI heterozygote. Derfor er mutagenese på målet ikke et kritisk problem i laboratoriemusen, som har en relativt rask livssyklus og er et produktivt dyr. Imidlertid vil ytterligere forbedring være nødvendig når denne teknologien brukes på relativt store pattedyr.
Det er bekreftet at denne teknologien kan produsere genkassett-inn-mus i andre innavlede stammer enn C57BL/6J, men et tilstrekkelig antall prosjekter er ikke sikret, og dataene er svært varierende. Denne informasjonen er derfor ikke inkludert i denne studien. Det antas at videre studier om dette emnet vil være nødvendig for å fremme musegenetikk og sykdomsmodellforskning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av vitenskapelig forskning (B) (19H03142: til SM), vitenskapelig forskning (A) (20H00444: til FS), vitenskapelig forskning (A) (21H04838: til SM), og vitenskapelig forskning på innovative områder “Platform of Advanced Animal Model Support” (16H06276: til ST) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeidelse av manuskript. Vi er takknemlige for Ryoichi Mori for hans nyttige diskusjon om genomredigeringsdesign.
Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
crRNA | IDT | – | |
Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
hCG | ASKA Animal Health | – | |
Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
Inverted microscope | Leica | ||
KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
Medetomidine | ZENOAQ | – | |
Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
Micromanipulator units | Narishige | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
PMSG | ASKA Animal Health | – | |
Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
RNase | QIAGEN | 19101 | |
RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
tracrRNA | IDT | – |