Som svar på den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi utvecklades ett laboratorieprotokoll för att testa den virala desinfektionseffekten av varmvattentvätt av tygbeläggningar, bomullsskrubbar och jeansbyxor. Phi6-viruset (bakteriofag) användes som organism för att testa desinfektionseffekten.
Detta protokoll ger ett exempel på en laboratorieprocess för att genomföra tvättstudier som genererar data om viral desinfektion. Medan protokollet utvecklades för forskning under coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi, är det avsett att vara ett ramverk som kan anpassas till andra virusdesinfektionsstudier; Det visar stegen för att förbereda testviruset, ympa testmaterialet, bedöma visuella och integritetsförändringar i de tvättade föremålen på grund av tvättprocessen och kvantifiera minskningen av virusbelastningen. Dessutom beskriver protokollet de nödvändiga kvalitetskontrollproverna för att säkerställa att experimenten inte är partiska av kontaminering och mätningar / observationer som bör registreras för att spåra materialintegriteten hos personlig skyddsutrustning (PPE) efter flera tvättcykler. De representativa resultaten som presenteras med protokollet använder Phi6-bakteriofagen inokulerad på bomullsskrubb, denim och bomullsansiktstäckande material och indikerar att tvätt- och torkningsprocessen för varmt vatten uppnådde över en 3-log (99.9%) minskning av virusbelastningen för alla prover (en 3-log-reduktion är desinfektionsprestandamåttet i US Environmental Protection Agency’s Product Performance Test Guideline 810.2200). Minskningen av virusbelastningen var enhetlig på olika platser på PPE-artiklarna. Resultaten av detta protokoll för virusdesinfektionseffektivitet bör hjälpa det vetenskapliga samfundet att utforska effektiviteten av hemtvätt för andra typer av testvirus och tvättprocedurer.
Coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi orsakade oöverträffade globala störningar i leveranskedjan och ledde till en kritisk brist på många artiklar, inklusive viktig personlig skyddsutrustning (PPE)1,2,3. De i högriskyrken var tvungna att anpassa sig med hjälp av rekommenderade kriskapacitetsstrategier och allmänheten antog användningen av icke-specialiserade föremål som ansiktsbeläggningar av tygmaterial främst för källkontroll, men också för att ge vissa andningsskydd för bärare. I USA reserverades specialiserade andningsskydd (dvs. filtrering av andningsskydd för ansiktsmasker (FFR) som N95) för några av dessa högriskyrken (t.ex. sjukvård) under leveransbrist4. När lite var känt om överföring av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-Cov-2), betraktades också en mängd andra typer av klädmaterial som barriärskydd tidigt i pandemin5. Med mångfalden av tyger som används för bärarskydd uppstod frågor om användning, återanvändning och desinfektion / dekontaminering av dessa föremål. Medan det i USA var allmänt accepterat att rutinmässig tvättning av ansiktsskydd och andra klädesplagg gjorde virus på dessa ytor icke-infektiösa, fanns det få data för att validera detta påstående, och det saknades publicerade laboratorieprotokoll för testning. Syftet med forskningsprotokollet som presenteras här är att ge ett exempel på en laboratorieprocess för att genomföra tvättstudier som genererar data om virusdesinfektion. Medan protokollet utvecklades för forskning under COVID-19-pandemin, är det avsett att vara ett ramverk som kan anpassas till andra virusdesinfektionsstudier.
Klädernas roll i sjukdomsöverföring är ett svårt begrepp att kvantifiera. International Scientific Forum on Home Hygiene försökte denna utmanande uppgift genom att genomföra en översyn av klädernas roll i spridningen av infektionssjukdomar i kombination med en riskbedömning av hemhygienpraxis6. Inkluderat i detta arbete var granskningen av flera vetenskapliga studier som undersökte överlevnaden av olika virusstammar på olika typer av tyger som ull och bomull 7,8,9,10,11. Varje studie fokuserade på en annan typ av virus inklusive vaccinia, poliovirus, respiratoriskt syncytialvirus, herpesvirus och influensavirus. Överlevnadstiderna för de olika virusen på tygerna varierade från 30 min till 5 månader beroende på kombinationen virus och material. Flera av studierna visade också på överföring av viruskontaminering från materialet till händerna. Som en del av publikationen diskuterades effektiv tvätt som en viktig hanteringsteknik för att minska överföringen men insåg att storleken på tvättens inverkan på att minska sjukdomsbördan var beroende av den specifika virusföroreningen och svår att kvantifiera 7,8,9,10,11.
Tvättprocessen förstör mikroorganismer med hjälp av kemiska, fysiska och termiska behandlingsprocesser. Till exempel kan tvålar och tvättmedel separera jordar och kan ge viss kemiskt medierad antimikrobiell verkan. Fysiskt kan utspädning och omrörning hjälpa till att minska virusbelastningen. En studie som undersökte uthålligheten hos humant coronavirus HCoV-OC43 på bomullsprover med industriella och hushållstvättcykler med och utan temperatur och tvättmedel fann inget detekterbart virus vid tvätt i ouppvärmt vatten utan tvättmedel, men att i närvaro av en jordbelastning (konstgjord saliv) krävde tvättcykler tvättmedel för att prover skulle ha icke-detekterande virusbelastningar12. Varmt vatten i sig kan också ge ett effektivt sätt att förstöra vissa mikroorganismer13,14.
I en nyligen publicerad publikation som sammanfattade tillståndet för nuvarande tvättpraxis identifierades många faktorer som tygsammansättning, lagringsförhållanden, smutsbelastning, tvätttemperatur och tid och torktemperatur som varierande i globala metoder för tvätt15. Även om tvätt är en vanlig rengöringsmetod för en stor andel av befolkningen, gör denna stora variation i befintliga metoder att utfärda detaljerad vägledning för hur man gör detta säkert och effektivt, när ett föremål kan vara förorenat av ett virus, utmanande och gles. Under COVID-19-pandemin utfärdade United States Centers for Disease Control and Prevention (CDC) vägledning om hur man tvättar föremål för husägare16,17. Mycket av denna tvättvägledning baserades på flera äldre studier om bakteriell desinfektion18,19 och stöddes av flera bänkstudier som har funnit höljeförsedda virus inaktiverade i vatten med tvättmedel20,21. Vägledningen kan sammanfattas som 1) följ tillverkarens instruktioner för tvättmedlet, 2) använd den varmaste lämpliga vatteninställningen och 3) torka föremål helt. Motiveringen till dessa rekommendationer var att tvätt på den varmaste möjliga cykeln med tvättmedel i kombination med torkning helt (med värme om möjligt) kommer att döda SARS-CoV-2-viruset.
Det stora antalet möjliga variationer i tvättprocessen kräver ett enhetligt protokoll, som presenteras här, för att kunna isolera variabler och testa virusdesinfektionseffekten hos specifika processer. Avsikten med detta protokoll i kombination med en instruktionsvideo är att demonstrera en laboratoriebaserad varmvattentvättprocess för replikering i andra forskningsstudier. Dessutom bör resultaten av denna virusdesinfektionseffektivitetstestning bygga konsumenternas förtroende för effektiviteten av hemtvätt under virusbaserade pandemier.
Detta protokoll utvecklades för att utföra systematiska laboratorietester för att bedöma tvätteffektiviteten av virusdesinfektion från fullstora PPE / klädesplagg. Förfarandena beskriver de kritiska stegen för att förbereda viruset, ympa testmaterialet, bedöma ändringarna av föremålen på grund av tvättprocessen och kvantifiera minskningen av virusbelastningen till följd av tvättprocessen (maskintvätt och torkning). Dessutom beskriver protokollet de nödvändiga kvalitetskontrollproverna för att säkerställa att experimenten inte är partiska av kontaminering och mätningar / observationer som bör registreras för att spåra den personliga skyddsutrustningens materialintegritet efter flera tvättcykler. Resultaten med Phi6 indikerar att varmvattentvättprocessen som används i detta protokoll uppnådde en minskning av virusbelastningen med mer än 3 loggar för alla prover (ansiktsskydd, scrubs och jeansbyxor). Virusbelastningsminskningen var också enhetlig på olika platser på PPE / klädesplagg. För att demonstrera 3-log-reduktion kräver detta protokoll användning av en hög virusbelastning och ett stabiliseringsmedel (nötköttsextrakt) som kanske inte är representativt för markbelastningen för alla situationer.
Minibrickor och kompakta torktumlare valdes för att optimera antalet replikatexperiment som kunde utföras i en utrymmesbegränsad miljö och för att hålla steriliseringen av utrustning och vattenvolym som användes under experimenten hanterbar för laboratoriepersonal. Som ett resultat av att använda minibrickan var sköljstegen manuella jämfört med de flesta hemtvättapplikationer som är helt automatiserade. Det är också viktigt att komma ihåg att maskintvätt dominerar i utvecklade länder, men handtvätt praktiseras fortfarande över hela världen15. Dessutom kanske vissa inte har tillgång till varmt vatten för tvätt, och andra manuellt lufttorkar kläder snarare än maskintorkning. Dessa skillnader i tvättpraxis togs inte upp i detta nuvarande protokoll men kunde lätt undersökas med mindre ändringar som att ersätta tvätt- och torkstegen med att använda en hink och en nära linje
Det har varit minimalt fokus på rengöring/desinficering av virusförorenade ansiktsskydd och gatukläder i den vetenskapliga litteraturen i full skala. Mer vanligt bedömer studier filtreringsprestandan hos ansiktsbeläggningar efter upprepad tvätt och torkning men utvärderar inte viral desinfektionseffekt27,28. utvärderade till exempel anpassad filtreringseffektivitet för tygmasker och modifierade procedurmasker och fann stor variation i prestanda, med enkla modifieringar som gav ökad passform och filtreringseffektivitet29. En annan studie tittade på filtreringseffektiviteten hos fyra tygmasker av olika material30, återigen med fokus på källkontroll eller personligt skydd. Detta kan bero på brist på specialisering för både den mikrobiella delen och mekanisk testning i samma laboratorium. Protokollet som presenteras här ger en utvärdering av desinfektionseffektivitet samt materialnedbrytning.
Det har nyligen publicerats ett antal dekontaminerings-/desinfektionsmetoder för andningsskydd för engångsbruk (främst N95) i den vetenskapliga litteraturen31,32,33. Det primära fokuset på FFR (t.ex. N95s) beror på det kritiska andningsskydd de tillhandahåller för vårdpersonal och andra yrken i frontlinjen. Primär teknik för respiratordekontaminering involverade förångad väteperoxid (VHP), ultraviolett bakteriedödande strålning (UVGI) och fuktig värme (ånga) för virusinaktivering. utvärderade fem dekontamineringsmetoder för FFR och UVGI; etylenoxid och VHP visade sig vara de mest lovande saneringsmetoderna31. utvärderade fyra olika dekontamineringsmetoder – UV-ljus, torr värme, 70% etanol och VHP – för deras förmåga att minska kontaminering med SARS-CoV-2 och deras effekt på N95 andningsfunktion32. Det finns många ytterligare studier om effektiv dekontamineringsteknik för FFR som sammanfattades och publicerades 202033. Dessa specialiserade metoder är dock inte tillgängliga eller utformade för att användas säkert av den genomsnittliga hem- eller småföretagaren.
Detta protokoll utvecklades med hjälp av Phi6, en omsluten bakteriofag som liknar SARS-CoV-2, har spikproteiner och är av liknande storlek (80-100 nm)34, för alla tester. Eftersom Phi6 inte är en känd patogen kan den manipuleras i ett allmänt mikrobiologiskt biosäkerhetsnivå 1 (BSL-1) laboratorium. Effekt mot Phi6 kan indikera effekten av andra höljeförsedda virus, men empirisk verifiering för varje virus av intresse är nödvändig35. Genom att använda ett liknande, icke-patogent virusmedel hoppas man att detta protokoll kan upprepas någon annanstans och användas för att studera framtida virusepidemier / pandemier. Framtida forskning kan inkludera användning av desinfektionsmedel (t.ex. blekmedel) förutom tvättmedel och ett standardiserat protokoll för handtvätt och linjetorkning.
The authors have nothing to disclose.
U.S. Environmental Protection Agency (EPA) genom sitt kontor för forskning och utveckling ledde den forskning som beskrivs häri under EP-C-15-008 med Jacobs Technology Inc. Den har granskats av byrån men återspeglar inte nödvändigtvis byråns åsikter. Inget officiellt godkännande bör härledas. EPA stöder inte köp eller försäljning av kommersiella produkter eller tjänster. Författarna vill tacka EPA-entreprenörerna Denise Aslett för tillsynen av EPA RTP-mikrobiologin, Brian Ford, Rachael Baartmans och Lesley Mendez Sandoval för deras arbete med detta projekt i EPA RTP-mikrobiologilaboratoriet, Ramona Sherman för att tillhandahålla EPA-kvalitetssäkringsgranskningen och Worth Calfee och Shannon Serre för att tillhandahålla EPA-tekniska recensioner.
Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
Dextrose | Fisher | BP350 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
Washer | Kuppet | KP1040600A | |
Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
Yeast extract | Gibco | 212750 |