Qui, presentiamo un protocollo per isolare il mesenchima intestinale murino, compresi i telocytes. Questi possono essere utilizzati per diverse applicazioni, come la co-coltura con topo o organoidi di derivazione umana, per sostenere la crescita e riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.
L’intestino tenue murino, o mesenchima del colon, è altamente eterogeneo, contenente tipi di cellule distinte tra cui sangue ed endotelio linfatico, nervi, fibroblasti, miofibroblasti, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e il tipo di cellula recentemente identificato, i telociti. I telociti sono cellule mesenchimali uniche con lunghi processi citoplasmatici, raggiungendo una distanza da decine a centinaia di micron dal corpo cellulare. I telociti sono recentemente emersi come un importante componente di nicchia delle cellule staminali intestinali, fornendo proteine Wnt essenziali per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici.
Sebbene siano disponibili protocolli su come isolare il mesenchima dall’intestino del topo, non è chiaro se queste procedure consentano l’isolamento efficiente dei telociti. L’isolamento efficiente dei telocytes richiede speciali aggiustamenti del protocollo che consentirebbero la dissociazione del forte contatto cellula-cellula tra i telocytes e le cellule vicine senza influire sulla loro vitalità. Qui, i protocolli di isolamento del mesenchima intestinale disponibili sono stati adattati per supportare il successo dell’isolamento e della coltura del mesenchima contenente una resa relativamente elevata di telociti unicellulari vitali.
La sospensione monocellulare ottenuta può essere analizzata con diverse tecniche, come l’immunocolorazione, l’ordinamento cellulare, l’imaging e gli esperimenti di mRNA. Questo protocollo produce mesenchima con proprietà antigeniche e funzionali sufficientemente conservate dei telociti e può essere utilizzato per diverse applicazioni. Ad esempio, possono essere utilizzati per la co-coltura con organoidi derivati dal topo o dall’uomo per supportare la crescita degli organoidi senza integrazione di fattori di crescita, per riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.
Sia l’intestino tenue che il colon sono tessuti altamente rigenerativi a causa della presenza di cellule staminali, che proliferano e alimentano la rigenerazione1. Il mesenchima che circonda l’epitelio fornisce supporto strutturale e funzionale secernendo proteine della matrice extracellulare e molecole di segnalazione2, che modulano la risposta delle cellule epiteliali. I telociti sono grandi cellule mesenchimali, descritte principalmente al microscopio elettronico come cellule con lunghi processi citoplasmatici chiamati telopodi, che si sovrappongono per creare una rete labirintica 3,4,5,6,7. Recentemente, i telociti intestinali che esprimono il fattore di trascrizione FOXL1 sono emersi come un importante componente di nicchia delle cellule staminali che forniscono proteine Wnt, che sono cruciali per la funzione delle cellule staminali e progenitrici. I telociti intestinali esprimono alti livelli di proteine chiave della via di segnalazione come Wnt, Bmp, Tgfb e Shh, così come molti fattori di crescita8.
Dato che i telocytes sono un componente critico di nicchia delle cellule staminali de vivo, lo sviluppo di protocolli per isolarli e coltivarli ex vivo consentirà il loro uso come fonte di molecole di segnalazione e fattori di crescita, per supportare la crescita e la differenziazione ex vivo. Utilizzando protocolli consolidati, le cripte epiteliali del colon o dell’intestino possono essere isolate e formare strutture 3D note come organoidi 9,10,11. Gli organoidi tridimensionali rappresentano un potente strumento per indagare ex vivo sia la fisiologia che la patologia dell’epitelio intestinale. In un sistema ex vivo, gli organoidi si basano sull’integrazione esogena di fattori per la sopravvivenza e la crescita10. Il mesenchima isolato può essere coltivato con organoidi sia di topo che di derivazione umana e utilizzato come fonte di fattori di crescita, invece dell’integrazione esogena, per riflettere meglio la situazione nel tessuto originale. Lo studio dei telocytes ex vivo ha numerosi vantaggi nello studio dei comportamenti cellulari normali o patologici, dei meccanismi dell’omeostasi tissutale e delle interazioni cellula-cellula in modo più dettagliato.
Sebbene siano disponibili protocolli che descrivono come isolare il mesenchima dall’intestino del topo, non è chiaro se queste procedure portino all’isolamento efficiente dei telociti. Il successo dell’isolamento dei telocytes richiede speciali aggiustamenti del protocollo che consentirebbero la dissociazione del forte contatto cellula-cellula tra i telocytes e le cellule vicine, senza influire sulla loro vitalità. Per superare queste limitazioni, questo articolo presenta un protocollo modificato che produce costantemente una sospensione unicellulare altamente vitale contenente una quantità relativamente elevata di telociti con proprietà antigeniche e funzionali sufficientemente conservate. Questi telociti possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui la co-coltura con organoidi di origine murinaria o umana, per sostenere la crescita senza integrazione di fattori di crescita. Questo a sua volta riflette meglio la situazione nel tessuto originale.
Abbiamo utilizzato il modello 8 del topo FOXL1-Cre: Rosa-mTmG, in cui i telociti sono marcati con una versione legata alla membrana della proteina fluorescente verde (GFP) inverde, che consente allo sperimentatore di seguire i telociti nella loro interezza; tutte le altre cellule mesenchimali sono etichettate con un tdTomato legato alla membrana in rosso. L’attuale protocollo è stato modificato da un protocollo che isola il mesenchima intestinale12 per migliorare la resa e la vitalità dei telociti.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare il mesenchima dall’intestino tenue del topo utilizzando il modello murino FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG, che consente ai ricercatori di distinguere i telocytes da altre cellule mesenchimali. Ci sono alcuni passaggi critici da seguire in questo protocollo. In primo luogo, è importante agitare vigorosamente il tubo a quattro o cinque cicli, per scartare la maggior parte delle cellule epiteliali durante l’isolamento del mesenchima. Il tempo di incubazione per la digestione enzimatica deve essere ottimizzato in base all’efficienza della digestione. Durante l’incubazione, le piastre devono essere agitate delicatamente orizzontalmente per alcuni secondi ogni 20 minuti. Una volta che il tessuto diventa simile a un filamento, l’incubazione deve essere interrotta procedendo al passaggio del protocollo 2.12. L’esposizione del tessuto per lunghi tempi di digestione può comportare un basso tasso di vitalità cellulare e resa. Dopo la digestione enzimatica, il tubo deve essere scosso meccanicamente per rilasciare più singole cellule in sospensione; Idealmente, la soluzione dovrebbe apparire torbida e nessun frammento di tessuto dovrebbe essere visibile. In caso contrario, prolungare la digestione enzimatica a 60 minuti.
Mantenere condizioni sterili ed evitare potenziali contaminazioni batteriche è uno dei passaggi critici quando si lavora con la coltura di tessuti primari. Devono essere utilizzati strumenti di dissezione sterili, reagenti e tamponi; I guanti devono essere cambiati e l’area di lavoro deve essere pulita quando si lavora con gli animali. Una volta ottenuta la sospensione cellulare, il lavoro dovrebbe essere condotto sotto un cappuccio biologico laminare. Dopo la placcatura, le cellule devono essere incubate durante la notte senza disturbi, poiché ciò può influire sull’aderenza. Inoltre, è importante sostituire il terreno di coltura un giorno dopo la semina, poiché le cellule non aderenti possono influire sulla vitalità della coltura.
I marcatori di superficie utilizzati in questo protocollo hanno reagito fortemente con i loro epitopi; tuttavia, è possibile che la digestione enzimatica possa influenzare la reattività di legame e, quindi, i risultati dell’analisi FACS. Un’altra limitazione di questo protocollo è la sottorappresentazione dello strato muscolare. Per migliorare l’efficienza dell’isolamento delle cellule dello strato muscolare, raccomandiamo la separazione meccanica del muscolo dagli strati della mucosa e la digestione enzimatica separata per ciascuno degli strati. Per dissociare l’epitelio dallo stroma, possono essere utilizzati agenti di separazione meccanica o chelanti (EDTA o DTT); Tuttavia, la digestione enzimatica per ottenere singole cellule è stata ottimizzata in questo protocollo.
L’isolamento del mesenchima intestinale è stato precedentemente descritto8; raschiare via i villi con un coprislip causerebbe la perdita di alcuni mesenchimi accanto ai villi, in particolare le cellule mesenchimali della punta del villio come i telocytes13 della punta del villio Lgr5+. In questo protocollo, utilizziamo collagenasi di tipo VIII invece di dispasi II e tripsina in combinazione con DNasi I, poiché la collagenasi rilascia in modo più efficiente le cellule mesenchimali dalla matrice. Sebbene prolunghi il tempo di elaborazione (>90 minuti contro 35 minuti), i due protocolli hanno prodotto tassi di vitalità cellulare simili; L’attuale protocollo ha migliorato la resa delle cellule mesenchimali in generale, e più specificamente della frazione telocitaria. Il protocollo attuale ha prodotto circa il 10% di telociti GFP+, confermati sia dalla visualizzazione che dall’analisi FACS, mentre il protocollo precedente ha prodotto il 2% di telociti GFP+. Le principali differenze tra il protocollo attuale e i due protocolli di riferimento sono elencate nella tabella supplementare S1.
L’identificazione delle cellule FOXL1+GFP+ come telociti subepiteliali si basa su studi in vivo . La necessità di sviluppare e modificare i protocolli di isolamento dei mesenchimi disponibili per produrre rese più elevate di telociti e la conoscenza di come raggiungere questo obiettivo si basava sulla nostra comprensione della struttura e della funzione dei telocytes FOXL1+ in vivo, come grandi cellule con lunghe proiezioni cellulari strettamente attaccate alle cellule epiteliali.
È interessante notare che i telociti GFP+ ex vivo mostrano caratteristiche cellulari simili alle loro caratteristiche in vivo nell’intestino e sono, quindi, suggeriti per servire come supporto ideale per la crescita organoide. Sebbene questo protocollo discuta principalmente l’isolamento dei telociti dall’intestino tenue, un protocollo simile con piccole modifiche può essere utilizzato e facilmente applicato per le cellule mesenchimali del colon, come la cellula stromale intestinale (MRISC) regolata da MAP3K2 recentemente descritta12.
Una volta che le cellule mesenchimali si sono allungate e hanno raggiunto la confluenza, possono essere utilizzate per diverse applicazioni aggiuntive, come la co-coltura 3D con organoidi derivati da topi o umani, utilizzando Matrigel privo di fattori di crescita. Il mesenchima forma tipicamente una rete che supporta pienamente la formazione e la crescita degli organoidi senza supplementazione di fattori di crescita esogeni. Lo stroma intestinale ha caratteristiche 3D intrinseche che possono fornire all’epitelio un supporto meccanico14. Pertanto, questo protocollo può anche essere utilizzato per isolare il mesenchima da integrare in un’impalcatura bio-stampata 3D e utilizzato per ulteriori esperimenti di xenotrapianto.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science Foundation (MSC personal grant) e dal programma congiunto tra la Israel Science Foundation e la National Natural Science Foundation of China.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |