Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde med hög genomströmning för artificiell intelligens-driven segmentering av patologibekräftade regioner av intresse från färgade, tunna vävnadssektionsbilder för anrikning av histologiupplösta cellpopulationer med hjälp av lasermikrodissektion. Denna strategi inkluderar en ny algoritm som möjliggör överföring av avgränsningar som betecknar cellpopulationer av intresse direkt till lasermikroskop.
Tumörmikromiljön (TME) representerar ett komplext ekosystem som består av dussintals distinkta celltyper, inklusive tumör-, stroma- och immuncellpopulationer. För att karakterisera variation på proteomnivå och tumörheterogenitet i stor skala behövs metoder med hög genomströmning för att selektivt isolera diskreta cellulära populationer i solida tumörmaligniteter. Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde med hög genomströmning, aktiverat av artificiell intelligens (AI), som segmenterar bilder av hematoxylin och eosin (H&E) -färgade, tunna vävnadssektioner i patologibekräftade regioner av intresse för selektiv skörd av histologiupplösta cellpopulationer med hjälp av lasermikrodissektion (LMD). Denna strategi inkluderar en ny algoritm som möjliggör överföring av regioner som betecknar cellpopulationer av intresse, kommenterade med hjälp av digital bildprogramvara, direkt till lasermikroskop, vilket möjliggör mer enkla samlingar. Framgångsrik implementering av detta arbetsflöde utfördes, vilket demonstrerade nyttan av denna harmoniserade metod för att selektivt skörda tumörcellpopulationer från TME för kvantitativ, multiplexerad proteomisk analys genom högupplöst masspektrometri. Denna strategi integreras helt med rutinmässig histopatologisk granskning, utnyttjar digital bildanalys för att stödja anrikning av cellulära populationer av intresse och är helt generaliserbar, vilket möjliggör harmoniserade skördar av cellpopulationer från TME för multiomiska analyser.
TME representerar ett komplext ekosystem befolkat av ett mycket varierat utbud av celltyper, såsom tumörceller, stromaceller, immunceller, endotelceller, andra mesenkymala celltyper och adipocyter, tillsammans med en komplex extracellulär matris1. Detta cellulära ekosystem varierar inom och mellan olika sjukdomsorganplatser, vilket resulterar i komplex tumörheterogenitet 2,3. Nya studier har visat att heterogena tumörer och tumörer med låg tumörcellitet (låg renhet) ofta korrelerar med dålig sjukdomsprognos 2,3.
För att förstå det molekylära samspelet mellan tumör- och icke-tumörcellpopulationer inom TME i stor skala är standardiserade strategier med hög genomströmning nödvändiga för att selektivt skörda distinkta cellulära populationer av intresse för nedströms multiomisk analys. Kvantitativ proteomik representerar en snabbt utvecklande och allt viktigare teknik för att främja förståelsen av cancerbiologi. Hittills har övervikten av studier som använder proteomik gjort det med proteiner extraherade från hela tumörvävnadspreparat (t.ex. kryopulveriserade), vilket leder till en brist i förståelsen av heterogenitet på proteomnivå i TME 4,5,6.
Utvecklingen av provinsamlingsstrategier som sömlöst integreras med och utnyttjar information från kliniska patologiarbetsflöden kommer att möjliggöra en ny generation av histologiupplöst proteomik som i hög grad kompletterar guldstandard, diagnostiska patologiarbetsflöden. LMD möjliggör direkt och selektiv insamling av cellulära subpopulationer eller regioner av intresse (ROI) genom mikroskopisk inspektion av histologiskt färgade vävnadstunna sektioner7. De senaste stora framstegen inom digital patologi och AI-aktiverad analys har visat förmågan att identifiera unika sammansättningsegenskaper och AVKASTNING inom TME på ett automatiserat sätt, varav många korrelerar med molekylära förändringar och kliniska sjukdomsegenskaper, såsom resistens mot terapi och sjukdomsprognos8.
Arbetsflödet som beskrivs i protokollet som presenteras här utnyttjar kommersiella mjukvarulösningar för att selektivt kommentera tumör-ROI inom digitala histopatologiska bilder och använder mjukvaruverktyg som utvecklats internt för att överföra dessa tumör-ROI till lasermikroskop för automatiserad insamling av diskreta cellulära populationer av intresse som sömlöst integreras med nedströms multiomiska analysarbetsflöden. Denna integrerade strategi minskar avsevärt LMD-operatörens tid och minimerar den varaktighet under vilken vävnader måste vara vid omgivningstemperatur. Integrationen av automatiserat funktionsval och LMD-skörd med kvantitativ proteomik med hög genomströmning demonstreras genom en differentiell analys av TME från två representativa epiteliala äggstockscancer histologiska subtyper, högkvalitativ serös äggstockscancer (HGSOC) och äggstocksklarcellscancer (OCCC).
Även om det har funnits flera studieprejudikat som syftar till att utveckla och/eller förbättra arbetsflöden för anrikning av målcellulära subpopulationer från FFPE och/eller färskfrysta vävnader och metoder för att upprätthålla provkvaliteten under bearbetningen 9,12,13,14,15, finns det ett betydande behov av att utveckla automatiserade strategier för att förbereda kliniska vävnadsprover för molekylära analyser för att minska variationen och öka reproducerbarheten. Detta arbetsflöde beskriver ett standardiserat, halvautomatiserat protokoll som integrerar befintliga programvaruverktyg för bildanalys (se materialförteckningen) för histologiupplöst skörd av diskreta cellpopulationer av LMD från kliniska vävnadsprover.
Rumsligt upplöst LMD-anrikning av ROI som fångar diskreta cellpopulationer representerar ett nästa generations vävnadsbehandlingssteg före multiomiska analyser för att förbättra molekylär karakterisering och identifiering och underlätta upptäckt av cellselektiva biomarkörer. Detta protokoll förbättrar befintliga metoder genom att minska den ofta långa exponeringen av vävnadssektioner för den omgivande miljön som är förknippad med manuell segmentering av ROI av en histolog (vilket kan ta >1-2 timmar före LMD-samlingen). Det här arbetsflödet gör att ROI i stället kan föridentifieras genom AI-guidad klassificering och segmentering. Att begränsa vävnadens uppehållstid kommer att minska falska variationer i bedömningarna av mycket labila molekylära mål, såsom fosfopeptider och mRNA, eller för antikroppsbaserade analystekniker som förlitar sig på att ett målprotein är i sin ursprungliga konformation för detektion.
Att klippa snygga kalibratorfiducialer på PEN-membranglaset som är tydligt synliga i den skannade bilden är en av nyckelkomponenterna som möjliggör integration av bildanalysprogramvaran (se materialtabellen) med LMD-arbetsflödet. Genom att säkerställa att kalibratorerna har en exakt (“ren”) punkt längst ner på “V”-formen kan du välja en exakt punkt i bildanalysprogramvaran för de kalibratorlinjer som ska dras från, enligt beskrivningen i steg 5.1.6 och 5.2.13. Justering av dessa punkter under import till LMD-programvaran är avgörande för korrekt överlagring av anteckningarna (underlättas genom generering av en kompatibel .xml-fil med hjälp av algoritmerna “Malleator” och / eller “Dapọ”) på relevant vävnadsavkastning på den fysiska LMD-bilden. Det är nödvändigt att markera alla former och kollektivt “dra och släppa” på plats även när inriktningen är exakt vid import till LMD-programvaran för att registrera den vertikala (z-plan) positionen för glidsteget på lasermikroskopet. Mindre justeringar av placeringen av anteckningarna över vävnadens ROI kan också göras under detta steg, om det behövs.
En begränsning med den nuvarande versionen av Malleator-algoritmen är att den inte är kompatibel med de fördefinierade anteckningsformverktygen som tillhandahålls av bildanalysprogramvaran (se materialtabellen), även om framtida uppdateringar/versioner av algoritmen kommer att syfta till att förbättra denna kompatibilitet. ANNOTERINGSFILEN för former som ritas med dessa verktyg innehåller bara två uppsättningar parade x- och y-koordinater för varje anteckning, utan fullständig rumslig orientering runt dessa punkter. Den aktuella användningen av dessa verktyg resulterar i att anteckningarna konverteras till raka linjer som definieras av endast två punkter under importprocessen. Manuell definition av ROI-segment för mjukpapper krävs för framgångsrik konvertering till XML-format och LMD-import. Detta kan antingen utföras genom att manuellt definiera varje ROI med individuella frihandspolygonala anteckningar som är specifika för målområdet eller genom att tillämpa en approximativ cirkulär eller rektangulär anteckning över alla vävnads-ROI-segment, om så önskas, och kommer att vara kompatibel med detta arbetsflöde.
Medan arbetsflödet som presenteras här demonstrerades för proteomisk analys av nyfrysta mänskliga cancervävnadsprover, kan detta AI-drivna LMD-arbetsflöde användas på motsvarande sätt med FFPE-vävnader, icke-cancerösa vävnadstyper och de från icke-mänskliga källor. Det kan också stödja andra nedströms molekylära profileringsarbetsflöden, inklusive transkriptomiska, genomiska eller fosfoproteomiska analyser. Detta arbetsflöde kan också utnyttja andra användningsområden för bildanalysprogramvaran (se materialförteckningen), inklusive med funktioner associerade med cellräkning eller andra analytiska moduler, inklusive modulen “Multiplex IHC” eller “Tissue Microarray (TMA) Add-on”. Framtida tillämpningar av detta arbetsflöde kan också dra nytta av att fördefiniera antalet celler per ROI-segment, vilket säkerställer ekvivalenta cellulära ingångar över flera samlingar, eller genom att använda alternativa metoder för att definiera cellulära ROI av intresse, såsom genom immunohistokemi eller cellsociologi.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för detta projekt tillhandahölls delvis av Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 och HU0001-16-2-00014) till Uniformed Services University för Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorerna hade ingen roll i utformningen, genomförandet, tolkningen eller skrivandet av studien. Friskrivning: De åsikter som uttrycks här är författarnas och återspeglar inte den officiella politiken för Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller US Government.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |