조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서
Summary
병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
내이는 달팽이관과 현관을 사용하여 소리를 감지하고 균형을 유지합니다. 그것은 유모 세포로 알려진 전용 기계 감각 세포 유형을 사용하여 이를 수행합니다. 내이에 대한 기초 연구는 유모 세포가 어떻게 기능하는지, 그리고 조절 장애가 어떻게 청력 상실과 현기증을 유발할 수 있는지에 대한 깊은 이해로 이어졌습니다. 이 연구에서 마우스는 탁월한 모델 시스템이었습니다. 그러나 마우스는 모든 포유류와 마찬가지로 유모 세포를 대체 할 수있는 능력을 상실했습니다. 따라서 내이 기능 회복을위한 세포 요법을 이해하려고 할 때 다른 척추 동물 종에 대한 보완 연구는 더 많은 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 조류의 청각 상피 인 기저 유두 (BP)는지지 세포 (SC)에 의해 삽입 된 기계 감각 유모 세포 (HC)로 구성된 상피 시트입니다. 기저 유두와 포유류 달팽이관의 해부학 적 구조는 다르지만 내이 발달과 청력의 분자 메커니즘은 비슷합니다. 이것은 기저 유두를 비교 연구뿐만 아니라 재생을 이해하는 데 유용한 시스템으로 만듭니다. 여기에서는 닭 내이의 해부 및 조작 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 내이 발달의 분자 메커니즘을 연구하기위한 강력한 도구를 제공하는 유전 적 및 소분자 억제 방법을 보여줍니다. 이 논문에서는 CRIPSR-Cas9 결실을 사용하여 기저 유두를 유 전적으로 교란시킨 다음 기저 유두를 해부하는 ovo 전기 천공 기술에 대해 논의합니다. 우리는 또한 상피와 유모 세포의 발달을 관찰하기 위해 BP 기관 배양과 배양 매트릭스의 최적 사용을 보여줍니다.
Introduction
모든 척추동물의 내이는 귀 플라코드 1,2로 알려진 단순한 상피에서 파생됩니다. 이것은 청각 및 균형 인식과 관련된 기계 감각 정보를 전달하는 데 필요한 모든 구조적 요소와 세포 유형을 발생시킵니다. 내이의 섬모 센서인 유모 세포(HC)는 지지 세포(SC)로 둘러싸여 있습니다. HC는 여덟 번째 뇌신경의 뉴런을 통해 청각 후뇌에 정보를 전달합니다. 이들은 또한 otic placode3에서 생성됩니다. 소리의 일차 변환은 청각 HC의 정점 표면에서 기계적으로 민감한 모발 다발4을 통해 달성됩니다. 이것은 입체 섬모라고 불리는 변형 된 액틴 기반 돌출부를 통해 매개되며, 이는 등급이 매겨진 계단 패턴5로 배열됩니다. 또한, kinocilium이라고하는 변형 된 1 차 섬모는 모발 다발 형성을 조직하고 입체 섬모 6,7,8의 가장 높은 줄에 인접 해 있습니다. 입체 섬모의 구조는 음향 에너지에서 파생 된 기계적 자극을 전기 신경 신호로 변환하는 데 중요합니다9. 노화, 감염,이 음향 외상 또는이 독성 쇼크를 통한 청각 HC 손상은 포유류에서 돌이킬 수없는 부분 또는 완전한 청력 상실을 초래할 수 있습니다10.
그러한 손상을 복구 할 수있는 세포 대체 요법이 제안되었습니다11,12. 이 연구의 접근법은 포유류 유모 세포의 정상적인 발달을 이해하고 내이 내에 존재할 수있는 전구 세포에서 발달 프로그램이 재개 될 수 있는지 묻는 것이 었습니다13. 두 번째 접근법은 포유류 외부, 조류14,15와 같이 청각 유모 세포의 강력한 재생이 일어나는 비 포유류 척추 동물을 살펴 보는 것입니다. 조류에서, 유모 세포 재생은 주로 지지 세포를 전구세포와 유사한 상태로 역분화시킴으로써 발생하고, 이어서 유모 세포 및 지지 세포(16)를 생성하기 위한 비대칭 유사분열 분열을 통해 일어난다. 또한, 유모 세포를 생성하는 지지세포의 직접 분화도 관찰되었다17.
조류 청각 발달 메커니즘은 포유류의 메커니즘과 상당한 유사점을 보여 주지만 차이점이 있습니다18. 병아리 BP에서의 HC 및 SC 분화는 배아 일 (E) 7에서 명백하며, 시간이 지남에 따라 더욱 뚜렷해진다. E12에 의해, 잘 패턴화되고 잘 편광된 기저 유두(BP)가 가시화될 수 있고, E17에 의해 잘 발달된 유모 세포가19로 보일 수 있다. 이러한 시점은 분화, 패턴 및 극성뿐만 아니라 유모 세포 성숙의 메커니즘에 대한 창을 제공합니다. 그러한 메커니즘이 보존되는지 또는 발산되는지 이해하는 것은 기계 감각 유모 세포의 기원에 대한 깊은 상동성에 대한 통찰력을 제공하기 때문에 중요합니다.
여기에서는 내이 기관의 발달 전반에 걸쳐 증식, 운명 사양, 분화, 패턴 화 및 유지와 같은 세포 과정을 연구하기 위해 초기 및 후기 배아 단계에서 수행되는 일련의 기술을 보여줍니다. 이것은 체외이식편 배양20,21,22에서 내이 발달을 이해하는 다른 프로토콜을 보완합니다. 우리는 먼저 난자 전기천공을 사용하여 E3.5 이주머니 내의 BP 전구체에 외인성 DNA 또는 RNA를 도입하는 것에 대해 논의합니다. 유전자 조작이 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 이렇게 생성 된 표현형은 다방성이며 결과적으로 혼란 스러울 수 있습니다. 이것은 세포 골격 리모델링과 같은 기본 과정이 세포 분열, 조직 형태 형성 및 세포 전문화에서 여러 역할을 하는 후기 내이 발달 중에 특히 그렇습니다. 우리는 배양 된 체외 이식편에서 약리학 적 억제를위한 프로토콜을 제시하며, 이는 투여 량과 치료시기 및 기간을 제어하는 데 이점을 제공하여 발달 메커니즘의 정확한 시공간 조작을 제공합니다.
작은 억제제의 치료 기간에 따라 다른 장기 배양 방법을 활용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 상피 형태 형성과 세포 전문화에 대한 통찰력을 제공하는 두 가지 장기 배양 방법을 보여줍니다. 콜라겐을 매트릭스로 사용하여 달팽이관을 배양하는 3D 배양 방법은 발달 중인 BP의 강력한 배양 및 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 입체섬모의 형성을 이해하기 위해 상피 조직이 뻣뻣한 매트릭스에서 배양되어 액틴 돌출부가 자유롭게 성장할 수 있도록 하는 막 배양 방법을 제시합니다. 두 방법 모두 라이브 셀 이미징, 면역 조직 화학, 주사 전자 현미경 (SEM), 세포 기록 등과 같은 다운 스트림 처리를 허용합니다. 이러한 기술은 조류 청각 상피의 발달, 성숙 및 재생을 이해하고 조작하기 위한 모델 시스템으로 병아리를 효과적으로 사용하기 위한 로드맵을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
병아리는 실험실에서 내이를 연구하는 데 사용할 수 있는 모델 유기체에 비용 효율적이고 편리한 추가 물입니다. 여기에 설명 된 방법은 우리 실험실에서 일상적으로 사용되며 포유류 내이에 대한 지속적인 연구를 보완합니다. ovo에서 전기 천공은 병아리 게놈에 유전자 조작을 도입하는 데 사용됩니다. 전기천공은 또한 특정 세포 기관 또는 세포하 구조(35, <sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB 및 Royal National Institute for the Deaf의 지원에 감사드립니다. 벵갈루루 헤사라가타에 있는 중앙 가금류 개발 기구 및 교육 기관에 감사드립니다. NCBS의 CIFF 및 EM 시설 및 실험실 지원에 감사드립니다. Tol2-eGFP 및 T2TP 구조체의 Yoshiko Takahashi 및 Koichi Kawakami와 HCA 및 G19 Pcdh15 항체의 Guy Richardson에게 감사드립니다. 프로토콜에 대한 지속적인 지원과 귀중한 피드백에 대해 Earlab 회원들에게 감사드립니다.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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