Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen
Summary
Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.
Abstract
Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 – oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.
Introduction
Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht1. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.
Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist4. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt 5. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.
Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist 2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.
Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht13. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP14 retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.
Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe S…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960180), der Zinke Heritage Foundation und der Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01) unterstützt. Wir danken Prof. Longbao Lv (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, China) für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Affenaugäpfel.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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