인플루엔자 A 바이러스 감염 동안 단백질을 절단하는 카스파아제와 그 모티프 식별
Summary
인플루엔자 A 바이러스 (IAV) 감염은 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하는 카스파 제를 활성화시켜 프로 바이러스 및 항 바이러스 기능을 갖습니다. 억제제, RNA 간섭, 부위 지향 돌연변이 유발, 웨스턴 블로팅 및 RT-qPCR 기술을 사용하여 숙주 코르탁틴 및 히스톤 탈아세틸라제를 절단하는 감염된 포유류 세포의 카스파제를 식별했습니다.
Abstract
시스테인 프로테아제 계열인 Caspases는 미생물 감염을 포함한 다양한 자극에 반응하여 프로그램된 세포 사멸을 조정합니다. 처음에는 세포 사멸에 의해 발생하는 것으로 설명 된 프로그램 된 세포 사멸은 이제 세 가지 상호 연결된 경로, 즉 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사 증을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 함께 하나의 과정 인 PANoptosis로 만들어졌습니다. 영향 바이러스(IAV) 감염은 다양한 카스파제의 활성화를 유도하여 포유류 세포에서 PANoptosis를 유도하고, 이는 차례로 다양한 숙주 및 바이러스 단백질을 절단하여 숙주 선천적 항바이러스 반응의 활성화 또는 길항성 숙주 단백질의 분해와 같은 과정을 유도합니다. 이와 관련하여, 숙주 코르탁틴, 히스톤 탈아세틸라제 4 (HDAC4), 및 히스톤 탈아세틸라제 6 (HDAC6)의 카스파제 3-매개 절단이 IAV 감염에 반응하여 동물 및 인간 상피 세포 모두에서 발견되었다. 이를 입증하기 위해 억제제, RNA 간섭 및 부위 지시 돌연변이 유발을 사용했으며, 이어서 절단에 대한 절단 또는 저항성 및 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6 폴리펩티드의 회복을 웨스턴 블롯팅으로 측정했습니다. 이러한 방법은 RT-qPCR과 함께 IAV 또는 기타 인간 및 동물 바이러스의 감염 중에 카스파제 매개 절단을 겪는 바이러스 단백질뿐만 아니라 숙주를 식별하는 간단하면서도 효과적인 전략을 형성합니다. 본 프로토콜은이 전략의 대표적인 결과를 자세히 설명하고이를 더 효과적으로 만드는 방법도 논의합니다.
Introduction
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 Orthomyxoviridae 계열의 프로토 타입 구성원이며 전 세계적으로 전염병과 예측할 수없는 전염병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. IAV는 일반적으로 “독감”으로 알려진 인간 호흡기 질환, 인플루엔자를 유발합니다. 상기 독감은 숙주 전염증성 및 항염증성 선천성 면역 반응의 유도 및 인간 호흡기에서 상피 세포의 사멸을 초래하는 급성 질환이다. 두 과정 모두 프로그램 된 세포 사멸1이라는 현상에 의해 지배됩니다. 프로그램된 세포 사멸에 대한 신호 전달은 다양한 병원체 인식 수용체가 숙주 세포에서 들어오는 바이러스 입자를 감지하는 즉시 유도됩니다. 이것은 감염된 세포의 죽음을 프로그래밍하고 pyroptosis, 세포 사멸 및 괴사라고 불리는 세 가지 상호 연결된 경로에 의해 인접한 건강한 세포에 신호를 보냅니다 – 최근에는 하나의 과정 인 PANoptosis1로 만들어졌습니다.
PANoptosis는 유도에서 실행까지 많은 숙주 및 바이러스 단백질의 단백질 분해 처리를 포함합니다. 이러한 단백질 처리는 주로 카스파제 1,2라고 하는 시스테인 프로테아제 계열에 의해 주도됩니다. 최대 18 개의 카스파제 (카스파제 1에서 카스파제 18까지)가 알려져 있습니다3. 대부분의 카스파제는 프로 카스파제로 표현되며 바이러스 감염과 같은 자극에 반응하여자가 촉매 또는 다른 카스파 아제4에 의해 자체 단백질 분해 처리를 통해 활성화됩니다. IAV에 감염된 세포의 PANoptosis는 숙주 방어 메커니즘으로 생각되었지만 IAV는 복제를 촉진하기 위해이를 회피하고 이용하는 방법을 진화 시켰습니다 1,2,5,6. 그 중 하나는 본질적으로 항 바이러스이거나 IAV 수명주기의 단계 중 하나를 방해하는 카스파 제 매개 절단 또는 분해를 통해 숙주 인자를 길항하는 것입니다. 이를 위해, 숙주 인자, 코르탁틴, HDAC4 및 HDAC6는 IAV에 감염된 상피 세포 7,8,9에서 카스파제 매개 절단 또는 분해를 겪는 것으로 밝혀졌다. HDAC4 및 HDAC6는 항 IAV 인자 8,10이며, 코르 탁틴은 감염의 후기 단계, 잠재적으로 바이러스 조립 및 출아 11 동안 IAV 복제를 방해합니다.
또한, 다양한 카스파아제가 활성화되고, 이는 차례로 IAV 감염 동안 숙주 염증 반응을 활성화시키기 위해 여러 단백질을 절단한다 1,2. 또한, 핵 단백질 (NP), IAV 12,13,14의 이온 채널 M2 단백질 및 다른 바이러스 3,15,16의 다양한 단백질도 감염 중에 카스파 제 매개 절단을 겪어 바이러스 병인에 영향을 미친다. 따라서, 바이러스 발병기전의 분자적 기초를 이해하기 위해 IAV 및 다른 바이러스 감염 동안 숙주 및 바이러스 단백질의 카스파제 매개 절단 또는 분해를 지속적으로 연구할 필요가 있다. 본원에서, 상기 방법은 (1) 카스파제에 의한 이러한 단백질의 절단 또는 분해를 평가하고, (2) 이들 카스파제를 확인하고, (3) 절단 부위를 위치시키기 위해 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스는 숙주 요인과 경로를 자신의 이익에 맞게 조정한다는 것이 입증되었습니다. 차례로, 숙주 세포는 다양한 전략을 사용함으로써 그것에 저항합니다. 이러한 전략 중 하나는 숙주 세포가 바이러스 감염에 대한 항바이러스 전략으로 사용하는 PANoptosis입니다. 그러나 IAV와 같은 바이러스는 PANoptosis에 대응하고이를 유리하게 악용하기 위해 자체 전략을 발전시켰습니다1,3,6.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (뉴질랜드), HS and J.C. Anderson Trust (더니든), 미생물학 및 면역학과 및 생물 의학 학교 (University of Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
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