Identifisere Caspases og deres motiver som spalter proteiner under influensa A-virusinfeksjon
Summary
Influensa A-virus (IAV) infeksjon aktiverer caspases som spalter vert og virale proteiner, som igjen har pro- og antivirale funksjoner. Ved å bruke inhibitorer, RNA-interferens, stedsrettet mutagenese og western blotting og RT-qPCR-teknikker, ble caspases i infiserte pattedyrceller som spalter vertskortaktin og histondeacetylaser identifisert.
Abstract
Caspases, en familie av cysteinproteaser, orkestrerer programmert celledød som respons på ulike stimuli, inkludert mikrobielle infeksjoner. Opprinnelig beskrevet å forekomme ved apoptose, er programmert celledød nå kjent for å omfatte tre sammenhengende veier: pyroptose, apoptose og nekroptose, sammen laget som en prosess, PANoptosis. Påvirkning Et virus (IAV) infeksjon induserer PANoptosis i pattedyrceller ved å indusere aktivering av forskjellige caspases, som igjen spalter forskjellige vert så vel som virale proteiner, noe som fører til prosesser som aktivering av vertens medfødte antivirale respons eller nedbrytning av antagonistiske vertsproteiner. I denne forbindelse har caspase 3-mediert spaltning av vertskortaktin, histon deacetylase 4 (HDAC4) og histon deacetylase 6 (HDAC6) blitt oppdaget i både dyre- og humane epitelceller som respons på IAV-infeksjonen. For å demonstrere dette ble inhibitorer, RNA-interferens og stedsrettet mutagenese brukt, og deretter ble spaltning eller motstand mot spaltning og gjenvinning av kortaktin-, HDAC4- og HDAC6-polypeptider målt ved vestlig blotting. Disse metodene, sammen med RT-qPCR, danner en enkel, men effektiv strategi for å identifisere verten så vel som virale proteiner som gjennomgår caspase-mediert spaltning under en infeksjon av IAV eller andre humane og animalske virus. Denne protokollen utdyper de representative resultatene av denne strategien, og måtene å gjøre den mer effektiv diskuteres også.
Introduction
Influensa A-virus (IAV) er det prototypiske medlemmet av Orthomyxoviridae-familien og er kjent for å forårsake globale epidemier og uforutsigbare pandemier. IAV forårsaker menneskelig luftveissykdom, influensa, kjent som “influensa”. Influensa er en akutt sykdom som resulterer i induksjon av vertspro- og antiinflammatoriske medfødte immunresponser og død av epitelceller i menneskets luftveier. Begge prosessene styres av et fenomen som kalles programmert celledød1. Signaleringen for programmert celledød induseres så snart forskjellige patogengjenkjenningsreseptorer fornemmer de innkommende viruspartiklene i vertsceller. Dette fører til programmering av død av infiserte celler og signalering til de nærliggende friske cellene ved tre sammenhengende veier kalt pyroptose, apoptose og nekroptose – nylig laget som en prosess, PANoptosis1.
PANoptose innebærer proteolytisk behandling av mange verts- og virusproteiner fra induksjon til utførelse. Slik behandling av proteiner ledes primært av en familie av cysteinproteaser kalt caspases 1,2. Opptil 18 caspases (fra caspase 1 til caspase 18) er kjent3. De fleste caspases uttrykkes som pro-caspases og aktiveres ved å gjennomgå sin egen proteolytiske behandling enten ved autokatalyse eller andre caspases4 som svar på en stimulus som en virusinfeksjon. PANoptosis av IAV-infiserte celler ble antatt å være en vertsforsvarsmekanisme, men IAV har utviklet måter å unngå og utnytte den for å lette replikasjonen 1,2,5,6. En av dem er å motvirke vertsfaktorene via caspase-mediert spaltning eller nedbrytning som enten er iboende antivirale eller forstyrrer et av trinnene i IAV-livssyklusen. Til dette formål har vertsfaktorer, cortactin, HDAC4 og HDAC6 blitt oppdaget å gjennomgå caspase-mediert spaltning eller nedbrytning i IAV-infiserte epitelceller 7,8,9. HDAC4 og HDAC6 er anti-IAV-faktorer 8,10, og kortaktin forstyrrer IAV-replikasjon på et senere stadium av infeksjon, potensielt under viral montering og spirende 11.
I tillegg aktiveres også forskjellige caspaser, som igjen spalter flere proteiner for å aktivere vertsinflammatorisk respons under IAV-infeksjon 1,2. Videre gjennomgår nukleoprotein (NP), ionkanal M2-protein av IAV 12,13,14 og forskjellige proteiner av andre virus 3,15,16 også caspasemediert spaltning under infeksjon, noe som påvirker viral patogenese. Derfor er det et kontinuerlig behov for å studere caspase-mediert spaltning eller nedbrytning av verts- og virusproteiner under IAV og andre virusinfeksjoner for å forstå det molekylære grunnlaget for viral patogenese. Her presenteres metodene for å (1) vurdere spaltning eller nedbrytning av slike proteiner av caspases, (2) identifisere disse caspasene og (3) lokalisere spaltningsstedene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er fastslått at virus skreddersyr vertsfaktorene og veiene til deres fordel. I sin tur motstår vertscellene det ved å bruke ulike strategier. En av disse strategiene er PANoptosis, som vertsceller bruker som en antiviral strategi mot virusinfeksjoner. Imidlertid har virus som IAV utviklet sine egne strategier for å motvirke PANoptose og utnytte det til deres fordel 1,3,6. Dette samspillet innebærer spaltning av forskjel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren anerkjenner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice og Phyllis Paykel Trust (New Zealand), HS og JC Anderson Trust (Dunedin), og Institutt for mikrobiologi og immunologi og School of Biomedical Sciences (University of Otago).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
