Идентификация каспаз и их мотивов, которые расщепляют белки во время вирусной инфекции гриппа А
Summary
Инфекция вируса гриппа А (IAV) активирует каспазы, расщепляющие хозяина, и вирусные белки, которые, в свою очередь, обладают про- и противовирусными функциями. Используя ингибиторы, интерференцию РНК, сайт-направленный мутагенез и методы западного блоттинга и RT-qPCR, были идентифицированы каспазы в инфицированных клетках млекопитающих, которые расщепляют кортактин хозяина и гистоновые деацетилазы.
Abstract
Caspases, семейство цистеиновых протеаз, организует запрограммированную гибель клеток в ответ на различные раздражители, включая микробные инфекции. Первоначально описанная как происходящая апоптозом, запрограммированная гибель клеток в настоящее время, как известно, охватывает три взаимосвязанных пути: пироптоз, апоптоз и некроптоз, вместе придуманные как один процесс, PANoptosis. Вирусная инфекция (IAV) вызывает PANoptosis в клетках млекопитающих, индуцируя активацию различных каспаз, которые, в свою очередь, расщепляют различные белки-хозяева, а также вирусные белки, что приводит к таким процессам, как активация врожденного противовирусного ответа хозяина или деградация антагонистических белков-хозяев. В связи с этим каспаза 3-опосредованное расщепление кортактина хозяина, гистондеацетилазы 4 (HDAC4) и гистондеацетилазы 6 (HDAC6) было обнаружено как в эпителиальных клетках животных, так и в эпителиальных клетках человека в ответ на инфекцию IAV. Чтобы продемонстрировать это, были использованы ингибиторы, интерференция РНК и сайт-направленный мутагенез, и, впоследствии, расщепление или устойчивость к расщеплению и восстановление кортактина, HDAC4 и HDAC6 полипептидов были измерены с помощью западного блоттинга. Эти методы в сочетании с RT-qPCR образуют простую, но эффективную стратегию идентификации хозяина, а также вирусных белков, подвергающихся опосредованному каспазой расщеплению во время заражения IAV или другими вирусами человека и животных. В настоящем протоколе излагаются репрезентативные результаты этой стратегии, а также обсуждаются пути повышения ее эффективности.
Introduction
Вирус гриппа А (IAV) является прототипным членом семейства Orthomyxoviridae и, как известно, вызывает глобальные эпидемии и непредсказуемые пандемии. IAV вызывает респираторные заболевания человека, грипп, широко известный как «грипп». Грипп является острым заболеванием, которое приводит к индукции про- и противовоспалительных врожденных иммунных реакций хозяина и гибели эпителиальных клеток в дыхательных путях человека. Оба процесса управляются явлением, называемым запрограммированной гибелью клеток1. Передача сигналов о запрограммированной гибели клеток индуцируется, как только различные рецепторы распознавания патогенов воспринимают входящие вирусные частицы в клетках-хозяевах. Это приводит к программированию смерти инфицированных клеток и передаче сигналов соседним здоровым клеткам тремя взаимосвязанными путями, называемыми пироптозом, апоптозом и некроптозом, недавно придуманным как один процесс, PANoptosis1.
PANoptosis включает в себя протеолитическую обработку многих белков-хозяев и вирусных белков от индукции до исполнения. Такая обработка белков в первую очередь возглавляется семейством цистеиновых протеаз, называемых каспазами 1,2. Известно до 18 каспаз (от каспазы 1 до каспазы 18). Большинство каспаз экспрессируются как прокаспазы и активируются путем прохождения собственной протеолитической обработки либо автокатализом, либо другими каспазами4 в ответ на стимул, такой как вирусная инфекция. PANoptosis IAV-инфицированных клеток считался защитным механизмом хозяина, но IAV разработал способы уклонения и использования его для облегчения его репликации 1,2,5,6. Одним из них является антагонизм факторов хозяина посредством опосредованного каспазой расщепления или деградации, которые либо по своей сути являются противовирусными, либо мешают одной из стадий жизненного цикла IAV. С этой целью было обнаружено, что факторы хозяина, кортактин, HDAC4 и HDAC6 подвергаются опосредованному каспазой расщеплению или деградации в инфицированных IAV эпителиальных клетках 7,8,9. HDAC4 и HDAC6 являются анти-IAV факторами 8,10, а кортактин препятствует репликации IAV на более поздней стадии инфекции, потенциально во время вирусной сборки и почкования11.
Кроме того, также активируются различные каспазы, которые, в свою очередь, расщепляют несколько белков, чтобы активировать воспалительную реакцию хозяина во время инфекции IAV 1,2. Кроме того, нуклеопротеин (NP), белок М2 ионного канала IAV 12,13,14 и различные белки других вирусов 3,15,16 также подвергаются каспазно-опосредованному расщеплению во время инфекции, что влияет на вирусный патогенез. Поэтому существует постоянная потребность в изучении опосредованного каспазой расщепления или деградации белков-хозяев и вирусных белков во время IAV и других вирусных инфекций, чтобы понять молекулярную основу вирусного патогенеза. В настоящем описании представлены способы (1) оценки расщепления или деградации таких белков каспазами, (2) идентификации этих каспаз и (3) локализации участков расщепления.
Protocol
Representative Results
Discussion
Установлено, что вирусы адаптируют факторы и пути хозяина к своей выгоде. В свою очередь, клетки-хозяева сопротивляются этому, используя различные стратегии. Одной из таких стратегий является PANoptosis, который клетки-хозяева используют в качестве противовирусной стратегии против вирусны…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор признает Дженнифер Типпер, Билана Ли, Джесси ванВестринена, Кевина Харрода, Да-Юань Чена, Фарджану Ахмед, Соню Мрос, Кеннета Ямаду, Ричарда Уэбби, BEI Resources (NIAID), Совет по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии, Фонд Мориса и Филлис Пайкель (Новая Зеландия), Фонд H.S. и J.C. Anderson Trust (Данидин), а также Департамент микробиологии и иммунологии и Школу биомедицинских наук (Университет Отаго).
Materials
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -. D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -. D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -. D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, 290-297 (2015).
