동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 프로토콜
Summary
이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
Abstract
동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 감귤류와 전 세계적으로 150종 이상의 다른 과일 작물에 피해를 주는 매우 침습적이고 적응력이 뛰어난 해충 종입니다. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 암컷은 과일 껍질 아래에 알을 낳기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 일반적으로 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 분자 생물학적 도구와 고처리량 시퀀싱 기술의 개발로 많은 과학자들이 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 여기에는 다양한 해충에서 검색 행동에 관여하는 후각 유전자와 같은 유전자 (분자 표적)를 하향 조절하거나 침묵시키는 RNAi 또는 유전자 편집 기반 살충제가 포함됩니다. 동양 초파리 방제에 대한 이러한 전략을 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다. B. dorsalis의 생존과 번식에 중요한 기능을 가진 유전자는 유전자 녹다운 및/또는 침묵을 위한 좋은 분자 표적 역할을 합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 특히 곤충에서 유전자 편집에 사용되는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 B. dorsalis의 CRISPR / Cas9 돌연변이 유발에 대한 체계적인 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
Introduction
동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 구아바, 망고, 유지니아 종, 수리남 체리, 감귤류, 비파, 파파야1을 포함한 150종 이상의 과일 작물에 피해를 입히는 국제적인 해충 종입니다. 광둥성(중국)에서만 발생한 피해액은 2억 위안 이상으로 추산된다. 성체 암컷은 숙성 또는 익은 과일의 껍질 아래에 알을 삽입하여 과일의 부패와 이탈을 유발하여 과일의 품질과 작물의 전체 수확량을 감소시킵니다2. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 유충이 과일 피부에 구멍을 뚫기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 또한 살충제의 광범위한 사용으로 인해 다양한 농약에 대한 B. dorsalis 의 저항성이 증가하여 이러한 해로운 해충의 방제가 더욱 어려워졌습니다3. 따라서 효과적이고 환경 친화적 인 해충 관리 전략의 개발이 절실히 필요합니다.
최근 분자생물학적 도구와 고처리량 염기서열분석 기술의 발달로 과학자들은 다양한 해충의 중요한 유전자(분자 표적)의 기능을 표적으로 하는 RNAi와 같은 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 해충의 생존과 번식에 중요한 유전자는 기능적 유전자 연구를 통해 확인할 수 있으며 특정 표적화되고 환경 친화적 인 해충 관리 도구4의 개선을위한 잠재적 인 분자 표적 역할을합니다. 이러한 전략을 동양 초파리 방제에 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다.
CRISPR/Cas(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련) 엔도뉴클레아제 시스템은 박테리아와 고세균에서 처음 발견되었으며 박테리오파지 감염에 의해 도입된 것과 같은 외래 세포 내 DNA의 인식 및 분해에 관여하는 적응 메커니즘으로 밝혀졌습니다.5. 유형 II CRISPR 시스템에서 Cas9 엔도뉴클레아제는 작은 관련 RNA(crRNA 및 tracrRNA)에 의해 유도되어 침입 DNA 6,7,8을 절단하며 현재까지 유전자 편집에 가장 널리 사용되는 도구 중 하나가 되었습니다 9,10,11,12. CRISPR/Cas9 시스템은 유전자 침묵의 높은 효율과 저렴한 비용과 같은 몇 가지 장점을 가지고 있기 때문에 이미 Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 및 Bombyx mori16을 포함한 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었습니다. B. dorsalis에서 체색, 날개 이형성 및 성 결정과 관련된 유전자는 CRISPR / Cas917,18,19를 사용하여 성공적으로 녹아웃되었습니다. 그러나 이 곤충에 CRISPR/Cas9를 적용하기 위한 자세한 절차는 아직 불완전합니다. 또한 B. dorsalis 유전자 편집을 위해 연구자들이 제공하는 일부 단계도 다양하며 표준화가 필요합니다. 예를 들어, Cas9의 형태는 출판된 참고 문헌17,18,19에서 달랐습니다.
이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 B. dorsalis 의 돌연변이 유발을 위한 체계적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 시스템은 가장 널리 사용되는 유전자 편집 도구이며 유전자 렙기(30), 작물 육종(31) 및 유전자 기능(32)의 기초 연구와 같은 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 시스템은 이미 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었으며 해충의 기능적 유전자 연구에 효과적인 도구로 사용되었습니다. 여기에서 제시하는 프로토콜은 가이드 RNA?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272) 및 심천 Dapeng 신구의 과학 기술 혁신 및 산업 발전을위한 특별 기금 (보조금 번호. PT202101-02).
Materials
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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