Cet article présente les protocoles étape par étape pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis. Les étapes détaillées fournies par ce protocole normalisé serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.
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Article de méthode
Protocoles pour la mutagenèse CRISPR/Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis
Dans cet article
Résumé
Résumé
La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis, est une espèce de ravageur très envahissante et adaptative qui cause des dommages aux agrumes et à plus de 150 autres cultures fruitières dans le monde. Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que les femelles pondent leurs œufs sous la peau des fruits, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent généralement de mauvais résultats au champ. Avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologie de séquençage à haut débit, de nombreux scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement. Il s’agit notamment de pesticides basés sur l’ARNi ou l’édition de gènes qui régulent à la baisse ou réduisent au silence les gènes (cibles moléculaires), tels que les gènes olfactifs impliqués dans la recherche du comportement, chez divers insectes nuisibles. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires. Les gènes ayant des fonctions critiques dans la survie et la reproduction de B. dorsalis servent de bonnes cibles moléculaires pour l’élimination et/ou le silençage des gènes. Le système CRISPR/Cas9 est une technique fiable utilisée pour l’édition de gènes, en particulier chez les insectes. Cet article présente une méthode systématique pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ces protocoles serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs intéressés par les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.
Introduction
La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis , est une espèce d’insecte ravageur cosmopolite qui cause des dommages à plus de 150 espèces de cultures fruitières, dont la goyave, la mangue, Eugenia spp., la cerise du Surinam, les agrumes, le nèfle et la papaye1. Les dégâts causés dans la seule province du Guangdong (Chine) sont estimés à plus de 200 millions de yuans. Les femelles adultes insèrent leurs œufs sous la peau des fruits mûrs ou mûrs, provoquant la pourriture et l’abscission du fruit, ce qui diminue la qualité des fruits et le rendement global de la culture2. Étant donné que les mouches des frui....
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Protocole
1. Conception de cibles et synthèse in vitro de l’ARNg
- Prédire la structure des gènes cibles d’intérêt et déterminer les limites entre les exons et les introns grâce à l’analyse bioinformatique du génome de B. dorsalis (les applications logicielles utilisées ici sont répertoriées dans le tableau des matériaux).
REMARQUE: BLAT20 a été utilisé pour rechercher des loci génétiques potentiels dans le génome. Les lectures de séquençage d’ARN de haute qualité (transcriptome) ont été alignées sur les loci génétiques acquis à l’aide de Hisat221. Samtools
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Résultats
Ce protocole présente des étapes détaillées pour le développement de mutants de B. dorsalis à l’aide de la technologie CRISPR / Cas9, y compris des résultats représentatifs de la sélection de l’ADNg, de la collecte d’embryons et de la micro-injection, de l’entretien des insectes et du dépistage des mutants.
L’exemple du site cible du gène sélectionné est situé dans le troisième exon (Figure 1C). Ce site est hautement conservé, et une seule bande a été dét.......
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Discussion
Le système CRISPR/Cas9 est l’outil d’édition de gènes le plus largement utilisé et a diverses applications, telles que la sélection génique30, la sélection des cultures31 et les études fondamentales des fonctions génétiques32. Ce système a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes et a servi d’outil efficace pour les études de gènes fonctionnels chez les ravageurs. Les protocoles que nous présentons ici normalisent la pr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le programme scientifique et technologique de Shenzhen (subvention n ° KQTD20180411143628272) et des fonds spéciaux pour l’innovation en science, la technologie et le développement industriel du nouveau district de Shenzhen Dapeng (subvention n ° PT202101-02).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 6x Tampon de chargement d’ADN | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Chambre climatique artificielle | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Mini-Extraction d’ADN génomique | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA Pour la recherche de loci génétiques potentiels dans le génome | |
| Verre capillaire | WPI ; | 1B100F-4 | |
| Micromanipulateur Eppendorf InjectMan 4 | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Kit de synthèse d’ARNg | de précision Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA Pour aligner le transcriptome sur les loci de gènes acquis | |
| IGV | NA NA | Pour visualiser les résultats du transdécodeur | |
| Microbroyeur | NARISHIGE | EG-401 | |
| Microscope | Olympus Corporation Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Kit de clonage | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Solution de rouge de phénol | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Livre de recettes à pipette 2018 P-97 & P-1000 Extracteurs de micropipettes | Instrument Company ; | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA Pour | générer les fichiers bam triés |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Extracteur de micropipette Sutter ; | Compagnie d’instruments ; | P-97 | |
| Trans2K Marqueur d’ADN | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdécodeur | NA | NA | Pour combiner les résultats de l’assemblage des transcrits et des informations sur les loci géniques https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biologique détecteur | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
Références
- Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. P....
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Réimpressions et autorisations
