通过分子建模方法探索半胱天冬酶突变和翻译后修饰
Summary
本协议使用生物分子模拟包，并描述了用于模拟野生型半胱天冬酶及其突变形式的分子动力学（MD）方法。MD方法允许评估半胱天冬酶结构的动态演变以及突变或翻译后修饰的潜在影响。
Abstract
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，可消除受损细胞并控制多细胞生物的发育和组织稳态。半胱天冬酶是半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的启动和执行中起关键作用。半胱天冬酶的成熟及其活性通过翻译后修饰以高度动态的方式进行微调。为了评估翻译后变化的影响，潜在的位点经常发生突变，残基对任何修饰都持续存在。例如，丝氨酸残基被丙氨酸或天冬氨酸取代。然而，这种取代可能会改变半胱天冬酶活性位点的构象，导致催化活性和细胞功能的紊乱。此外，位于关键位置的其他氨基酸残基的突变也可能破坏半胱天冬酶的结构和功能，导致细胞凋亡扰动。为了避免使用突变残基的困难，可以很容易地应用分子建模方法来估计氨基酸取代对半胱天冬酶结构的潜在影响。该协议允许使用生物分子模拟包（琥珀）和超级计算机设施对野生型半胱天冬酶及其突变形式进行建模，以测试突变对蛋白质结构和功能的影响。
Introduction
细胞凋亡是调节多细胞生物形态发生和组织稳态的最广泛研究的细胞过程之一。细胞凋亡可由广泛的外部或内部刺激引发，例如死亡受体的激活、细胞周期信号紊乱、DNA 损伤、内质网 （ER） 应激以及各种细菌和病毒感染1.半胱天冬酶 – 关键的凋亡参与者 – 通常分为两组：引发剂（半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-10）和效应物（半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7），这取决于它们的结构域结构和半胱天冬酶级联中的位置2，3。在细胞死亡信号上，引发剂半胱天冬酶与接头分子相互作用，促进邻近诱导的二聚化和自动处理以形成活性酶。效应半胱天冬酶通过引发剂半胱天冬酶的切割被激活，并通过切割多个细胞底物4来执行下游执行步骤。
引发剂和效应半胱天冬酶的成熟和功能受大量不同细胞内机制的调节，其中翻译后修饰在细胞死亡调节中起着不可或缺的作用5。添加修饰基团（磷酸化、亚硝基化、甲基化或乙酰化）或蛋白质（泛素化或 SUMO化）会改变半胱天冬酶的酶活性或调节细胞凋亡的蛋白质构象和稳定性。定点诱变被广泛用于研究潜在的翻译后修饰位点并识别其作用。推定的修饰位点通常被另一种氨基酸取代，该氨基酸不能进一步修饰。因此，潜在的磷酸化丝氨酸和苏氨酸突变为丙氨酸，赖氨酸泛素化位点被精氨酸取代。另一种策略包括替换特别模仿翻译后修饰的氨基酸（例如，谷氨酸和天冬氨酸已被用于模拟磷酸化的丝氨酸或苏氨酸）6。然而，位于活性位点附近或关键位置的一些取代物可能会改变半胱天冬酶结构，干扰催化活性并抑制凋亡细胞死亡7。在半胱天冬酶基因中肿瘤相关的错义突变的情况下也可以观察到类似的效果。例如，半胱天冬酶-6 – R259H的肿瘤相关突变导致底物结合口袋中环的构象变化，降低了底物8的有效催化周转。头颈部鳞状细胞癌中半胱天冬酶-8中的G325A氨基酸取代可能阻碍半胱天冬酶-8活性，导致核因子-kB（NF-kB）信号传导的调节，促进肿瘤发生9。
为了评估氨基酸取代对半胱天冬酶结构和功能的潜在影响，可以应用分子建模。这项工作描述了分子动力学（MD）方法，用于使用生物分子模拟包（Amber）模拟野生型半胱天冬酶及其突变形式。MD方法给出了引入突变后蛋白质结构动态演变的观点。琥珀包最初由Peter Kollman的团队开发，成为生物分子模拟10，11，12，13中最受欢迎的软件工具之一。该软件分为两部分：（1）AmberTools，常规用于系统准备（原子类型分配，添加氢和显式水分子等）和轨迹分析的程序集合;（2）琥珀色，以PMEMD模拟程序为中心。AmberTools 是一个免费软件包（也是安装 Amber 本身的先决条件），而 Amber 则以单独的许可证和费用结构分发。在超级计算机上和/或使用图形处理单元（GPU）进行并行模拟可以大大提高蛋白质结构动力学科学研究的性能14。最新的可用软件版本是AmberTools21和Amber20，但所描述的协议也可以与以前的版本一起使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
所描述的MD方法允许使用生物分子模拟包对半胱天冬酶的野生型和突变形式进行建模。这里讨论了该方法的几个重要问题。首先，需要从蛋白质数据库中选择半胱天冬酶的代表性晶体结构。重要的是，半胱天冬酶的单体和二聚体形式都是可以接受的。选择缺失残基数量最少的高分辨率结构是一个好主意。某些残基的质子化状态可以在输入PDB文件中手动设置。例如，在 图1中，…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了俄罗斯科学基金会（17-75-20102，协议开发）的资助。代表性结果部分（磷酸化分析）中描述的实验得到了斯德哥尔摩（181301）和瑞典（190345）癌症协会的支持。
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochimie. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. . AMBER 2020. , (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
