En face Préparation d’un coussin endocardique pour l’analyse de morphogenèse planaire chez des embryons de souris

Résumé

Classiquement, l’endocarde de la valve embryonnaire de souris primordium a été analysé en utilisant des coupes transversales, coronales ou sagittales. Notre nouvelle approche pour l’imagerie bidimensionnelle en face de l’endocarde dans les régions valvulogéniques permet une analyse de polarité plane et de réarrangement cellulaire de l’endocarde pendant le développement valvulaire.

Résumé

L’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents au développement du cœur des mammifères est essentielle pour traiter les cardiopathies congénitales humaines. Le développement des valves cardiaques primitives implique la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) des cellules endocardiques du canal auriculo-ventriculaire (AVC) et des voies d’écoulement (OFT) du cœur en réponse à des signaux myocardiques et endocardiques inductifs locaux. Une fois que les cellules se délaminent et envahissent la matrice extracellulaire (gelée cardiaque) située entre l’endocarde et le myocarde, les coussins endocardiques primitifs (EC) se forment. Ce processus implique que l’endocarde doit combler les lacunes laissées par les cellules délaminées et doit se réorganiser pour converger (étroit) ou s’étendre (allonger) le long d’un axe. Les recherches actuelles ont impliqué la voie de polarité cellulaire planaire (PCP) dans la régulation de la localisation subcellulaire des facteurs impliqués dans ce processus. Classiquement, les phases initiales du développement valvulaire cardiaque ont été étudiées dans des coupes transversales de cœurs embryonnaires ou dans des explants ex vivo AVC ou OFT cultivés sur des gels de collagène. Ces approches permettent l’analyse de la polarité apico-basale mais ne permettent pas l’analyse du comportement cellulaire dans le plan de l’épithélium ou des changements morphologiques des cellules migrantes. Ici, nous montrons une approche expérimentale qui permet la visualisation de l’endocarde dans les régions valvulogènes en tant que champ planaire de cellules. Cette approche expérimentale offre la possibilité d’étudier le PCP, la topologie plane et la communication intercellulaire au sein de l’endocarde de l’OFT et de l’AVC pendant le développement de la valve. Déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires impliqués dans la morphogenèse valvulaire cardiaque peut contribuer à la compréhension des cardiopathies congénitales associées aux anomalies du coussin endocardique.

Introduction

Le cœur est le premier organe fonctionnel d’un embryon de mammifère. Vers le jour embryonnaire (E) 7,5 chez la souris, les cellules bilatérales du mésoderme précardiaque forment le croissant cardiaque dans la face ventrale¹. Le croissant cardiaque contient deux populations de cellules précardiaques qui comprennent les progéniteurs du myocarde et de l’endocarde². Vers E8.0, les précurseurs cardiaques fusionnent dans la ligne médiane, formant le tube cardiaque primitif composé de deux tissus épithéliaux, le myocarde externe et l’endocarde interne, qui est un endothélium spécialisé séparé par une matrice extracellulaire app....

Protocole

Les études animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale du Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) et par la Communauté de Madrid (réf. PROEX 155.7/20). Toutes les procédures relatives aux animaux étaient conformes à la directive européenne 2010/63UE et à la recommandation 2007/526/CE concernant la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques, promulguée dans la loi espagnole en vertu du Real Decreto 1201/2005.

1. Obtention de CVA et/ou d’OFT (adapté de Xiao et al. ²⁵)

1. Mette....

Résultats

Les données générées à l’aide de ce protocole montrent qu’il est possible d’effectuer une imagerie faciale de l’endocarde de l’AVC. Le premier objectif était d’analyser la forme cellulaire de l’endocarde lors de la formation des valves à une résolution cellulaire (Figure 1). Afin de mettre en évidence les cellules endocardiques individuelles à E9.5, nous avons utilisé deux souches de souris transgéniques. (1) ROSA^mT/mG est un allèle rapporteur Cre fluorescent bic.......

Discussion

L’endocarde est une monocouche épithéliale qui recouvre toute la surface interne du tube cardiaque embryonnaire. Au cours du développement valvulaire, les cellules endocardiques des régions valvulaires potentielles subissent une EMT, de sorte que les cellules endocardiques transforment et réarrangent leur cytosquelette pour se délaminer de l’endocarde vers la gelée cardiaque. Nous et d’autres avons obtenu des données pertinentes sur le développement valvulaire chez les embryons de souris en analysant des sections transve.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-OH-Tamoxifène	Sigma Aldrich	H-6278
16 % Paraformaldheyde	Microscopie électronique Sciences	157-10	Diluer à 4 % dans l’eau
anti-GFP	Aves Labs	FGP-1010
anti-VECadherin	BD Biosciences	555289
Chèvre anti-Poulet, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11039
Chèvre Anti-Souris Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	115-605-174
DAPI	AppliChem	A4099,0005
Lames Superfrost PLUS	VWR	631-0108	25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	A4974,0500	AppliChem
Vectashield Montage	Laboratoires vectoriels	H-1000-10

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