Bestemme intestinal permeabilitet ved hjelp av lucifer gul i en apikal-ut enteroid modell
Summary
Denne protokollen skisserer en metode som benytter lucifer gul i en apikal-ut enteroid modell for å bestemme intestinal permeabilitet. Denne metoden kan brukes til å bestemme paracellulær permeabilitet i enteroider som modellerer inflammatoriske tarmsykdommer som nekrotiserende enterocolitt.
Abstract
Enteroider er et fremvoksende forskningsverktøy i studiet av inflammatoriske tarmsykdommer som nekrotiserende enterokolitt (NEC). De dyrkes tradisjonelt i den basolaterale ut (BO) konformasjonen, hvor den apikale overflaten av epitelcellen vender mot det indre lumen. I denne modellen er tilgang til den luminale overflaten av enteroider for behandling og eksperimentering utfordrende, noe som begrenser evnen til å studere vertspatogeninteraksjoner. For å omgå dette ble det opprettet en neonatal apikal-ut (AO) modell for nekrotiserende enterokolitt. Siden endringer i tarmepitelcellepermeabilitet er patognomoniske for NEC, skisserer denne protokollen ved bruk av lucifergul (LY) som markør for paracellulær permeabilitet. LY krysser tarmepitelbarrieren via alle de tre store paracellulære banene: pore, lekkasje og ubegrenset. Bruk av LY i en AO-modell gir mulighet for en bredere studie av permeabilitet i NEC. Etter IRB-godkjenning og foreldrenes samtykke ble kirurgiske prøver av tarmvev samlet inn fra humane premature nyfødte. Intestinale stamceller ble høstet via kryptisolasjon og brukt til å dyrke enteroider. Enteroider ble dyrket til modenhet og deretter transformert AO eller igjen i BO-konformasjon. Disse ble enten ikke behandlet (kontroll) eller ble behandlet med lipopolysakkarid (LPS) og utsatt for hypoksiske tilstander for induksjon av in vitro NEC. LY ble brukt til å vurdere permeabilitet. Immunfluorescerende farging av apikalproteinet zonula occludens-1 og basolateralt protein β-catenin bekreftet AO-konformasjon. Både AO- og BO-enteroider behandlet med LPS og hypoksi viste signifikant økt paracellulær permeabilitet sammenlignet med kontroller. Både AO- og BO-enteroider viste økt opptak av LY i lumen til de behandlede enteroidene sammenlignet med kontroller. Utnyttelsen av LY i en AO-enteroidmodell muliggjør undersøkelse av alle tre hovedveiene for paracellulær permeabilitet. Det tillater i tillegg undersøkelse av vertspatogeninteraksjoner og hvordan dette kan påvirke permeabiliteten sammenlignet med BO-enteroidmodellen.
Introduction
Enteroider er tredimensjonale (3D) strukturer avledet fra organbegrensede humane tarmstamceller 1,2. De består utelukkende av epitelavstamning og inneholder alle de differensierte tarmepitelcelletypene2. Enteroider opprettholder også cellulær polaritet som består av en apikal luminal overflate som danner et indre rom og en basolateral overflate som vender mot de omkringliggende mediene. Enteroider er en unik modell ved at de bevarer egenskapene til verten som deble generert 3. Dermed representerer enteroider generert fra premature menneskelige spedbarn en modell som er nyttig for å undersøke sykdommer som primært påvirker denne befolkningen, for eksempel nekrotiserende enterokulitt (NEC).
Den tradisjonelle enteroidmodellen dyrkes i en basolateral ut (BO) konformasjon, hvor enteroiden er innkapslet i en kuppel av kjellermembranmatrise (BMM). BMM induserer enteroiden for å opprettholde en 3D-struktur med den basolaterale overflaten på utsiden. BO enteroider er en egnet modell for NEC som bygger bro over gapet mellom todimensjonale (2D) primære humane cellelinjer og in vivo dyremodeller 2,4. NEC induseres i enteroider ved å plassere patogener som LPS eller bakterier i media rundt enteroider, etterfulgt av eksponering for hypoksiske forhold 2,3. Utfordringen med BO enteroid NEC-modellen er at den ikke tillater effektiv studie av vertspatogeninteraksjoner, som forekommer på den apikale overflaten in vivo. Endringer i intestinal permeabilitet skyldes disse vertspatogeninteraksjonene. For bedre å forstå hvordan permeabilitet påvirker det patofysiologiske grunnlaget for sykdom, må det opprettes en modell som innebærer behandling av den apikale overflaten.
Co og medarbeidere var de første som demonstrerte at modne BO-enteroider kan induseres til å danne en apikal-ut (AO) konformasjon ved å fjerne BMM-kuplene og resuspendere dem i media5. Denne artikkelen viste at AO-enteroider opprettholdt riktig epitelpolaritet, inneholdt alle tarmcelletyper, opprettholdt tarmepitelbarrieren og tillot tilgang til den apikale overflaten5. Ved å bruke AO-enteroider som en NEC-modell oppnår man en fysiologisk reproduksjon av sykdomsprosessen og studiet av vertspatogeninteraksjoner.
En viktig bidragsyter til patofysiologien til NEC er økt intestinal permeabilitet6. Flere molekyler har blitt foreslått som en måte å teste for intestinal permeabilitet in vitro7. Blant disse er lucifergult (LY) et hydrofilt fargestoff med eksitasjons- og utslippstopper på henholdsvis428 nm og 540 nm 8. Når den krysser gjennom alle de store paracellulære veiene, har den blitt brukt til å evaluere paracellulær permeabilitet i ulike applikasjoner, inkludert blod-hjerne- og tarmepitelbarrierer 8,9. Den tradisjonelle anvendelsen av LY bruker celler dyrket i monolag på en halvgjennomtrengelig overflate10. LY påføres den apikale overflaten og krysser gjennom paracellulære tette kryssproteiner for å samles på basolateral side. Høyere LY-konsentrasjoner i det basolaterale rommet indikerer reduserte tette koblingsproteiner med påfølgende nedbrytning av tarmepitelcellebarrierer og økt permeabilitet10. Det har også blitt beskrevet i 3D BO enteroidmodeller hvor LY ble lagt til media og individuelle enteroider ble avbildet for opptak av LY i lumen11. Selv om dette muliggjør kvalitativ analyse via visualisering av LY-opptak, er kvantitativ analyse begrenset. Denne protokollen skisserer en unik teknikk som bruker LY til å vurdere paracellulær permeabilitet ved hjelp av en in vitro NEC enteroidmodell i AO-enteroider samtidig som 3D-orientering opprettholdes. Denne metoden kan brukes til både kvalitativ og kvantitativ analyse av permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinal permeabilitet er kompleks og reflekterer epitelbarrierefunksjon. Tarmbarrieren består av et enkelt lag av epitelceller som formidler transcellulær og paracellulær transport14. Paracellulær permeabilitet er avhengig av tette kryssproteiner som forsegler rommet mellom epitelceller14. Innenfor denne paracellulære transporten er det tre forskjellige veier som molekyler kan krysse: pore, lekkasje og ubegrenset15. Poreveien tillater permeab…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Ashley Nelson fra University of Rochester Medical Center for hennes instrumentelle hjelp med vår enteroidmodell. Vi vil også takke Divisjon for pediatrisk kirurgi ved University of Oklahoma for deres støtte til dette prosjektet. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research, og Presbyterian Health Foundation Grant # 20180587 tildelt Department of Surgery ved University of Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
