Modellering af hjernemetastase ved intern halspulsåreinjektion af kræftceller

Summary

Hjernemetastase er en årsag til alvorlig sygelighed og dødelighed hos kræftpatienter. De fleste hjernemetastase musemodeller kompliceres af systemiske metastaser, der forvirrer analyse af dødelighed og terapeutiske interventionsresultater. Præsenteret her er en protokol for intern carotisinjektion af kræftceller, der producerer konsistente intrakranielle tumorer med minimale systemiske tumorer.

Abstract

Hjernemetastase er en årsag til alvorlig sygelighed og dødelighed hos kræftpatienter. Kritiske aspekter af metastatiske sygdomme, såsom det komplekse neurale mikromiljø og stromal celleinteraktion, kan ikke helt replikeres med in vitro-assays ; Dyremodeller er således afgørende for at undersøge og forstå virkningerne af terapeutisk intervention. Imidlertid producerer de fleste hjernetumor xenograferingsmetoder ikke hjernemetastaser konsekvent med hensyn til tidsrammen og tumorbyrden. Hjernemetastasemodeller genereret ved intrakardial injektion af kræftceller kan resultere i utilsigtet ekstrakraniel tumorbyrde og føre til ikke-hjernemetastatisk sygelighed og dødelighed. Selvom intrakraniel injektion af kræftceller kan begrænse ekstrakraniel tumordannelse, har den flere forbehold, såsom at de injicerede celler ofte danner en enestående tumormasse på injektionsstedet, høj leptomeningeal involvering og skade på hjernens vaskulatur under nåleindtrængning. Denne protokol beskriver en musemodel af hjernemetastase genereret ved intern carotisarterieinjektion. Denne metode producerer intrakranielle tumorer konsekvent uden involvering af andre organer, hvilket muliggør evaluering af terapeutiske midler til hjernemetastase.

Introduction

Hjernemetastase er en udbredt malignitet forbundet med en meget dårlig prognose ^1,2. Standarden for pleje af hjernemetastasepatienter er multimodal, bestående af neurokirurgi, helhjernestrålebehandling og / eller stereotaktisk radiokirurgi afhængigt af patienternes generelle sundhedsstatus, ekstrakraniel sygdomsbyrde og antallet og placeringen af tumorer i hjernen ^3,4. Patienter med op til tre intrakranielle læsioner er berettiget til kirurgisk resektion eller stereotaktisk radiokirurgi, mens helhjernestrålebehandling anbefales til patienter med flere læsioner for at undgå risikoen for kirurgisk relateret infektion og ødem⁵. Imidlertid kan hele hjernens strålebehandling forårsage skade på radiofølsomme hjernestrukturer, hvilket bidrager til dårlig livskvalitet⁶.

Systemisk terapi er en ikke-invasiv alternativ og logisk tilgang til behandling af patienter med flere læsioner⁷. Det overvejes dog mindre på grund af den mangeårige forestilling om, at systemiske terapier har dårlig effekt, fordi passiv levering af cytotoksiske lægemidler via blodbanen ikke kan opnå terapeutiske niveauer i hjernen uden risiko for usikker toksicitet⁸. Dette paradigme begynder at ændre sig med den nyligt godkendte systemiske behandling (tucatinib med trastuzumab og capecitabin indiceret til metastatisk HER2+ brystkræfthjernemetastase)9,10,11,12 og opdateringen i behandlingsretningslinjer til at omfatte overvejelse af systemiske behandlingsmuligheder for hjernemetastasepatienter^13,14.

I denne sammenhæng kan udviklingen inden for molekylær målrettet terapi, immunterapi og alternative lægemiddelleveringssystemer, såsom en målrettet nano-lægemiddelbærer, potentielt overvinde udfordringerne ved hjernemetastasebehandling^15,16,17,18. Derudover undersøges også kemiske og mekaniske tilgange til forbedring af lægemiddelafgivelse via permeabilisering af hjernetumorbarrieren^19,20. For at studere og optimere sådanne tilgange til at være egnede til formålet er det afgørende at anvende prækliniske modeller, der ikke kun afspejler den komplekse fysiologi af hjernemetastase, men også giver mulighed for objektiv analyse af intrakranielt lægemiddelrespons.

Generelt involverer de nuværende tilgange til modelhjernemetastase in vivo intracardiac (venstre ventrikel), intravenøs (normalt halevene), intrakraniel eller intracarotis (almindelig halspulsåre) injektion af kræftceller hos mus 21,22,23,24,25,26,27 . Bortset fra tumor engraftment strategier, genetisk manipulerede musemodeller, hvor tumordannelse udløses ved fjernelse af tumor suppressor gener eller aktivering af onkogener er nyttige til tumor modellering. Imidlertid rapporteres kun få genetisk manipulerede musemodeller at producere sekundære tumorer og endnu færre, der pålideligt producerer hjernemetastaser^28,29,30.

Engraftment metoder såsom intracardiac (venstre ventrikel) og intravenøs (normalt hale vene) injektion efterligne den systemiske spredning af kræft. Disse modeller producerer typisk læsioner i flere organer (f.eks. hjerne, lunger, lever, nyrer, milt) afhængigt af kapillærsengen, der fanger de fleste tumorceller under deres kredsløb ‘første ^pas’31. Imidlertid vil inkonsekvente hjernetransplantationshastigheder kræve flere dyr for at opnå stikprøvestørrelsen for den ønskede statistiske effekt. Antallet af tumorceller, der til sidst bliver etableret i hjernen via disse intrakardiale og intravenøse injektionsmetoder, er variabelt. Derfor kan hjernemetastase tumorbyrde variere mellem dyr, og forskellen i progression kan gøre standardisering af den eksperimentelle tidslinje og fortolkning af resultater til en udfordring. Den ekstrakranielle tumorbyrde kan føre til ikke-hjernemetastasedødelighed, hvilket gør disse modeller uegnede til evaluering af intrakraniel effekt. Hjerne-tropiske cellelinjer er blevet etableret ved hjælp af kunstige klonale selektionsprocesser for at reducere ekstrakraniel etablering, men optagelseshastigheder har været inkonsekvente, og den klonale udvælgelsesproces kan reducere heterogeniteten, der normalt findes i humane tumorer³².

Hjernespecifikke engraftmentmetoder såsom intrakraniel og intracarotisinjektion giver mulighed for mere konsekvent og effektiv hjernemetastasemodellering. I den intrakranielle metode³³ injiceres kræftceller typisk i den frontale hjernebark, som genererer hurtig og reproducerbar tumorudvækst med lav systemisk involvering. Mens proceduren tolereres godt med lav dødelighed³³, er advarslerne, at det er en relativt rå tilgang, der hurtigt introducerer en (lokaliseret) bolus af celler i hjernen og ikke modellerer tidlig hjernemetastasepatogenese. Nålen beskadiger hjernevævsvaskulaturen, som derefter forårsager lokaliseret betændelse ^5,34. Fra erfaring er der en tendens til, at tumorcelleinjektion til tilbagesvaling under fjernelse af nålen, hvilket fører til leptomeningeal involvering. Alternativt leverer intracarotismetoden celler ind i den fælles halspulsåre med hjernemikrovaskulatur som den første kapillærseng, der opstår, modellering af overlevelse i omløb, ekstravasation og kolonisering²⁴. I overensstemmelse med andre²⁵ fandt vores erfaring med denne metode, at den kan resultere i ansigtstumorer på grund af utilsigtet levering af kræftceller via den eksterne halspulsåre til kapillærsenge i disse væv (upublicerede data). Det er muligt at forhindre ansigtstumorer ved først at ligere den ydre halspulsåre før injektion af almindelig halspulsåre (figur 1). I resten af artiklen omtales denne metode som ‘indre halspulsåreinjektion’. Fra erfaring genererer den interne halspulsåreinjektionsmetode konsekvent hjernemetastase med meget få systemiske hændelser og har haft succes med at generere hjernemetastasemodeller af forskellige primære kræftformer (fx melanom, bryst- og lungekræft) (figur 1). Ulemperne er, at det er teknisk udfordrende, tidskrævende, invasivt og kræver omhyggelig optimering af cellenumre og en overvågningstidslinje. Sammenfattende producerer både de intrakranielle og interne carotisarterieinjektionsmetoder musemodeller, der er egnede til evaluering af terapeutisk indvirkning på hjernetumorrelateret overlevelsesfordel.

Denne protokol beskriver den interne carotisarterieinjektionsmetode til fremstilling af en musemodel af hjernemetastase med næsten ingen systemisk involvering og derfor egnet til præklinisk evaluering af lægemiddelfordeling og effektivitet af eksperimentel terapi.

Figur 1: Skematisk repræsentation af intern carotisarterieinjektionsprotokol for hjernemetastase. Intern halspulsåreinjektion med ekstern halspulsåreligation kan pålideligt producere en hjernemetastasemodel fra forskellige primære kræftformer. I denne protokol placeres tre ligaturer på halspulsåren (kommenteret som L1-L3 i figuren). Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Alle undersøgelser blev udført inden for retningslinjerne fra Animal Ethics Committee ved University of Queensland (UQCCR / 186/19) og den australske kode for pleje og brug af dyr til videnskabeligt formål. 1. Forberedelse af kræftceller til injektion BEMÆRK: I denne undersøgelse blev den humane brystkræftcellelinje, BT-474 (BT474), anvendt. BT474 blev dyrket i komplet vækstmedium bestående af RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovin …

Representative Results

Sammenligning af almindelig carotisarterieinjektion med eller uden ekstern halspulsåreligationNår kræftceller blev injiceret via den fælles halspulsåre uden først at ligere den ydre halspulsåre24, blev der fundet ansigtstumorer hos 77,8% af de podede mus (n = 7/9 dyr). Et eksempel på ansigtstumor er illustreret i supplerende figur 3. Metoden beskrevet i denne protokol forhindrer utilsigtet ansigtsmetastase ved at ligere den ydre halsp…

Discussion

Hjernemetastase er en kompleks proces af kræftceller, der spredes fra deres primære sted til hjernen. Der findes forskellige dyremodeller, der afspejler visse stadier af denne flertrinsproces, og der er fysiologiske og praktiske overvejelser ved at designe prækliniske metastasestudier^41,42. De fleste offentliggjorte undersøgelser, der undersøger brugen af nanomedicin til hjernemetastasebehandling, har brugt intrakardiale^43,44 og intra…

Materials

100µm cell strainer	Corning	CLS431752
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin syringe	BD	326103
Angled forceps	Proscitech	T67A-SS	Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm
Animal heat mat
Antibiotic and antimycotic	ThermoFisher Scientific	15240062
Autoclave bags
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line	ATCC	HTB-20
Buprenorphine (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Diet-76A	ClearH2O	72-07-5022
Dissection microscope
Ear puncher
Electric clippers
Fine angled forceps	Proscitech	DEF11063-07	Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Foetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium	ThermoFisher Scientific	14170120
Hydrogel	ClearH2O	70-01-5022
Isoflurane
Kimwipes Low lint disposable wipers	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Nose cone			Fashioned out of a microfuge tube
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Povidone-iodine solution	Betadine	2505692
PPE (glove, mask, gown, hairnet)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Sterile normal saline	ThermoFisher Scientific	TM4469
Sticky tape
Surgical board			A chopping board wrapped with autoclavable bag.
Surgical scissors	Proscitech	T104	Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm
Suture forcep/ Curved Brophy forceps	Proscitech	T113C	Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder)	Proscitech	TC1322-180	length 190 mm, ratchet clamp
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 tissue culture flask	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II surface disinfectant	Ceva
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
TrypLE Express dissociating medium	ThermoFisher Scientific	12605010