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Biologie

酸化重水素を用いた褐色脂肪組織における de novo 脂肪酸合成の定量的測定(英語)

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/64219
, , ,
1UCD Conway Institute and UCD Institute of Food and Health, School of Agriculture and Food Science,University College Dublin, 2Division of Endocrinology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 3Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, Cincinnati, 4Department of Pediatrics,University of Cincinnati College of Medicine

Summary

ここでは、in vivoで褐色脂肪組織における全脂肪酸de novo脂肪生成を分析するために、酸化重水素とガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)を利用した安価な定量法を紹介します。

Abstract

脂肪酸合成は、全身代謝ホメオスタシスやその他の生理学的および病理学的プロセスの制御において重要な機能的役割を果たす、複雑でエネルギーを必要とする代謝経路です。グルコース処理などの他の主要な代謝経路とは対照的に、脂肪酸合成は日常的に機能的に評価されていないため、代謝状態の解釈が不完全です。さらに、この分野の新規参入者に適した公開されている詳細なプロトコルが不足しています。ここでは、in vivoでの褐色脂肪組織における全脂肪酸de novo合成の分析のために、酸化重水素とガスクロマトグラフィー質量分析(GCMS)を利用した安価な定量法について説明します。この方法は、炭素源とは無関係に脂肪酸合成酵素の生成物の合成を測定するものであり、事実上すべての組織、任意のマウスモデル、および外部摂動下で潜在的に有用です。GCMSのサンプル調製とダウンストリーム計算の詳細が記載されています。褐色脂肪は、高レベルのde novo脂肪酸合成と代謝恒常性の維持に重要な役割を果たすため、分析に焦点を当てています。

Introduction

肥満とそれに関連する代謝性疾患は、現在および将来の世代を危険にさらすパンデミックです1,2。肥満に関連する代謝調節不全は、エネルギー摂取量と消費の不均衡の結果として一般的に単純化されますが、環境因子および内因性因子によって制御される多数の代謝経路に影響を与えます3。しかし、代謝調節不全の動物モデルで日常的に検査されている経路はごくわずかです。

一例として、グルコース廃棄は、おそらくポータブルグルコースモニターの使用が簡単であるため、グルコースおよびインスリン負荷試験によって日常的に測定されます4。全身のグルコースと脂質の酸化相対速度も、間接熱量測定アッセイからの呼吸交換比に基づいて日常的に推定されます5,6。しかし、代謝の他のすべての側面の大部分は、日常的に機能的に評価されていません。.これにより、代謝状態の解釈が不完全になり、治療の選択肢が失われます。そのような主な経路の1つは、de novo脂肪形成です。

de novo脂肪生成(DNL)は、前駆体から新しい脂肪酸を生成するプロセスです。グルコースは全身DNLに寄与する主要な前駆体であると考えられています7が、酢酸、果糖、乳酸、分岐鎖アミノ酸などの他の前駆体は、空間的および条件依存的に関連する炭素源であることが示されています8,9,10,11,12。DNLは代謝ホメオスタシスに大きく貢献し、正常な発達に不可欠です13。さらに、DNLの変化は、癌14,15および代謝16,17,18および心血管疾患19,20に関連しています。

DNL経路は、コア酵素成分であるATPクエン酸リアーゼ(ACLY)、アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC1/2)、および脂肪酸合成酵素(FAS)で構成されており、主に炭素数16の飽和脂肪酸であるパルミチン酸を生成します。しかし、奇数鎖脂肪酸や分岐鎖脂肪酸もより低い速度で生産することができる9。伸長酵素と脱酸酵素は、これらの脂肪酸をさらに修飾し、さまざまな機能(例えば、長期のエネルギー貯蔵や膜流動性の操作)に有用な多様な脂肪酸種を作り出します。

DNL酵素機構の発現は、少数の転写因子によって制御されています。これまでに最もよく報告されたのは、ステロール調節要素結合タンパク質(SREBP)ファミリー、炭水化物応答要素結合タンパク質(ChREBP)、および肝臓X受容体(LXR)21,22,23,24,25,26です。それらの機能は明らかに重複しているにもかかわらず、細胞型の優勢と生理学的または病理学的状態に基づく個々の調節が報告されています21,22,27,28。

驚くべきことに、DNL経路の選択されたステップに対する多くの阻害剤は、肥満、非アルコール性脂肪性肝疾患/非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)、および心血管疾患を含む多くの疾患に対して臨床使用が承認されているか、前臨床または臨床開発段階にあります29。これらの取り組みは、健康と病気におけるDNLの関連性を強調しています。

近年、de novo脂肪酸合成を定量的に評価する方法の採用が増加しています30。これを評価するための最も一般的な方法は、重標識水(D2O)の使用であり、重標識水素は、DNL基質NAPDH、アセチルCoA、およびマロニルCoAの水素との重水素交換を介して、合成中に直接的および間接的にアシル鎖に取り込まれます。このアプローチは人気が高まっていますが、この分野の新規参入者に適した公開されている詳細なプロトコルが不足しています。ここでは、Lee et al.31 によって以前に開発された計算を使用して、D2O およびガスクロマトグラフィー質量分析法 (GCMS) を使用して、FAS の生成物の de novo 合成を定量的に評価する方法を概説します。この方法は、炭素源とは無関係にde novo脂肪酸合成を測定するため、ほぼすべての組織、あらゆるマウスモデル、および外部摂動下で役立つ可能性があります。ここでは、DNLのレベルが高く、代謝恒常性の維持に重要な役割を果たす褐色脂肪組織(BAT)の分析に焦点を当てています。

Protocol

すべての実験は、シンシナティ小児病院医療センターの動物管理および使用委員会によって承認されました。 1. D2Oの調製 注:実験のばらつきを避けるために、実験期間中、すべてのマウスに十分な溶液/飲料水を準備してください。 腹腔内注射の場合:D 2 Oのリットルあたり9 gのNaClを溶解することにより、0.9%w / v生理食塩水…

Representative Results

ステップ1で説明したD2O投与量に基づいて、我々は典型的に、体内水分が2.5%から6%の範囲で濃縮され、体内水分中の重水素濃縮のベースラインレベルが1時間で急速に達成され、8%濃縮飲料水 を介して 研究期間中維持されることを見出す(図1)。継続的な定常状態の体内水分濃縮は、ステップ 6 で使用される計算の仮定であるため、新しい実験モデルで体内?…

Discussion

複雑な代謝経路間のバランスと相互作用を理解することは、代謝関連疾患の生物学的基盤を理解する上で不可欠なステップです。ここでは、de novo脂肪酸合成の変化を決定するための非侵襲的で安価な方法論を示します。この方法は、脂肪酸重水素濃縮31からのde novo合成フラックスを推定し、体内水中のD2Oの相対的な割合を決定するために重水素−アセ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

貴重な議論をしてくれたSanchez-Gurmacches氏とWallace氏の研究室メンバーに感謝します。この研究は、米国心臓協会(18CDA34080527 から JSG に、19POST34380545 から RM に)、NIH (R21OD031907 JSG )、CCHMC Trustee Award、CCHMC Center for Pediatric Genomics Award、CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award からの助成金によって支援されました。この研究は、シンシナティの消化器疾患研究コアセンターのNIH P30 DK078392によって部分的に支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。RTとMWは、UCD Ad Astra Fellowshipの支援を受けました。

Materials

4 mL Glass Vials Fisher Scientific 14-955-334
0.2 µm filter Olympus Plastic 25-244
26G needeled syringes BD 309597
Acetone Merck 34850
Acetonitrile Merck 900667
Blue GC screw cap with septa Agilent 5190-1599
Centrifuge Eppendorf 5424R
Chloroform Sigma 366927
Deuterium oxide Sigma 151882
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Merck B1378
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT)
Select FAME Column		 Agilent CP7419
EDTA tube Sarstedt 411395105
Ethanol Merck 51976
Hexadecenoic-d31 Acid Larodan 71-1631
Hexane Merck 34859
Methanol Merck 34860
Microcentrifuge tube Olympus Plastic 24-282
Mouse environmental chamber Caron Caron 7001-33
Potasium Chloride Fisher Bioreagents BP366-500
Potasium Phosphate MP Biomedicals 194727
SafeLock microcentrifuge tubes Eppendorf 30120086
Screw top amber GC vial Agilent 5182-0716
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Hydroxide Merck S5881
Sodium Phosphate, dibasic Fisher Bioreagents BP332-500
Sodium Sulfate Merck 239313
Sulfuric Acid Merck 258105
Vial insert Agilent 5183-2088
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Fatty Acid SynthesisDeuterium OxideNon-invasiveIsotope-labeled GlucoseMetabolic StatusChloroform-methanol ExtractionFatty Acid MethylationGC-MS Analysis
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Citer Cet Article
Turner, R., Mukherjee, R., Wallace, M., Sanchez-Gurmaches, J. Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide. J. Vis. Exp. (195), e64219, doi:10.3791/64219 (2023).
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