여기에서는 생체 내 갈색 지방 조직의 총 지방산 de novo 지방 형성 분석을 위해 산화중수소 및 가스 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 활용하는 저렴한 정량 분석법을 제시합니다.
지방산 합성은 전신 대사 항상성 및 기타 생리학적 및 병리학적 과정을 제어하는 데 중요한 기능적 역할을 하는 복잡하고 에너지가 많이 필요한 대사 경로입니다. 포도당 처리와 같은 다른 주요 대사 경로와 달리 지방산 합성은 일상적으로 기능적으로 평가되지 않아 대사 상태에 대한 불완전한 해석으로 이어집니다. 또한 해당 분야의 신규 이민자에게 적합한 공개적으로 사용 가능한 세부 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 생체 내 갈색 지방 조직에서 총 지방산 de novo 합성 분석을 위해 산화중수소 및 가스 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 활용하는 저렴한 정량 분석법을 설명합니다. 이 방법은 탄소원과 독립적으로 지방산 합성효소 생성물의 합성을 측정하며, 거의 모든 조직, 모든 마우스 모델 및 외부 섭동 하에서 잠재적으로 유용합니다. GCMS 및 다운스트림 계산을 위한 샘플 준비에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 우리는 높은 수준의 de novo 지방산 합성과 대사 항상성 유지에 중요한 역할로 인한 갈색 지방 분석에 중점을 둡니다.
비만과 관련 대사 질환은 현재와 미래 세대를 위험에 빠뜨리는 전염병이다 1,2. 일반적으로 에너지 섭취와 소비 사이의 불균형의 결과로 단순화되는 비만과 관련된 대사 조절 장애는 환경 및 내인성 요인에 의해 조절되는 많은 대사 경로에 영향을 미친다3. 그러나 대사 조절 장애의 동물 모델에서 일상적으로 테스트되는 경로는 소수에 불과합니다.
예를 들어, 포도당 폐기는 포도당 및 인슐린 내성 검사에 의해 일상적으로 측정되는데, 이는 휴대용 혈당 모니터의 사용이 간편하기 때문일 수 있다4. 전신 포도당 및 지질 산화 상대 속도는 또한 간접 열량계 분석의 호흡 교환 비율을 기반으로 일상적으로 추정됩니다 5,6. 그러나 신진대사의 다른 모든 측면의 대부분은 일상적으로 기능적으로 평가되지 않습니다. 이로 인해 신진대사 상태에 대한 불완전한 해석과 치료 옵션을 놓치게 됩니다. 이러한 주요 경로 중 하나는 de novo lipogenesis입니다.
DNL(De novo lipogenesis)은 전구체에서 새로운 지방산이 생성되는 과정입니다. 포도당은 전신 DNL7에 기여하는 주요 전구체로 간주되지만, 아세테이트, 과당, 젖산 및 분지 사슬 아미노산과 같은 다른 전구체는 공간 및 조건에 따라 관련 탄소원으로 나타났습니다 8,9,10,11,12. DNL은 대사 항상성에 중요한 기여를 하며 정상적인 발달에 필수적이다13. 또한 DNL의 변화는 암14,15 및 대사16,17,18 및 심혈관 질환19,20과 관련이 있습니다.
DNL 경로는 핵심 효소 성분인 ATP 시트르산염 리아제(ACLY), 아세틸-CoA 카르복실라아제(ACC1/2) 및 지방산 합성효소(FAS)로 구성되며, 이들은 주로 16탄소 포화 지방산인 팔미테이트를 생성합니다. 그러나, 홀수 사슬 및 분지쇄 지방산은 또한 더 낮은 비율로 생산될 수 있다9. 엘롱가제(Elongase) 및 탈포화효소(desaturase)는 이러한 지방산을 추가로 변형시켜 다양한 기능(예: 장기 에너지 저장 및 막 유동성 조작)에 유용한 다양한 범위의 지방산 종을 생성합니다.
DNL 효소 기계의 발현은 소수의 전사 인자에 의해 제어됩니다. 현재까지 가장 잘 설명된 것은 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP) 계열, 탄수화물 반응 요소 결합 단백질(ChREBP) 및 간 X 수용체(LXR)21,22,23,24,25,26입니다. 기능의 명백한 중복에도 불구하고 세포 유형 우성 및 생리학적 또는 병리학적 조건에 기반한 개별 규정이보고되었습니다 21,22,27,28.
놀랍게도, DNL 경로의 선택된 단계에 대한 많은 억제제가 비만, 비알코올성 지방간 질환/비알코올성 지방간염(NAFLD/NASH) 및 심혈관 질환을 포함한 여러 질병에 대해 임상적 사용 승인을 받았거나 전임상 또는 임상 개발 단계에 있다29. 이러한 노력은 건강과 질병에 대한 DNL의 관련성을 강조합니다.
최근 몇 년 동안, de novo 지방산 합성을 정량적으로 평가하는 방법의 사용이 증가했다30. 이를 평가하는 가장 일반적인 방법은 DNL 기질 NAPDH, 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 수소와의 중수소 교환을 통해 직접 및 간접적으로 합성하는 동안 무거운 표지된 수소가 아실 사슬에 통합되는 중질 표지수(D2O)를 사용하는 것입니다. 이 접근 방식이 인기를 얻고 있지만 이 분야의 신규 이민자에게 적합한 공개적으로 사용 가능한 세부 프로토콜이 부족합니다. 여기에서는 Lee et al.31이 이전에 개발한 계산을 사용하여D2O및 기체 크로마토그래피 질량분석법(GCMS)을 사용하여 FAS 생성물의 de novo 합성을 정량적으로 평가하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 탄소원과 독립적으로 de novo 지방산 합성을 측정하며, 거의 모든 조직, 모든 마우스 모델 및 외부 섭동 하에서 잠재적으로 유용합니다. 여기서는 DNL 수치가 높고 대사 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 갈색 지방 조직(BAT)의 분석에 중점을 둡니다.
복잡한 대사 경로 간의 균형과 상호 작용을 이해하는 것은 대사 관련 질병의 생물학적 기초를 이해하는 데 없어서는 안될 단계입니다. 여기에서, 우리는 de novo 지방산 합성의 변화를 결정하기 위한 비침습적이고 저렴한 방법론을 보여줍니다. 이 방법은 지방산 중수소 농축(31)으로부터 새로운 합성 플럭스를 추정하기 위한 계산과 체수(39)에서D2…
The authors have nothing to disclose.
귀중한 토론을 해주신 Sanchez-Gurmacches와 Wallace 연구실 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 심장 협회(18CDA34080527 JSG 및 19POST34380545 – RM), NIH(R21OD031907 – JSG), CCHMC Trustee Award, CCHMC Center for Pediatric Genomics Award, CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 신시내티에 있는 소화기 질환 연구 핵심 센터의 NIH P30 DK078392에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. RT와 MW는 UCD Ad Astra Fellowship의 지원을 받았습니다.
4 mL Glass Vials | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
0.2 µm filter | Olympus Plastic | 25-244 | |
26G needeled syringes | BD | 309597 | |
Acetone | Merck | 34850 | |
Acetonitrile | Merck | 900667 | |
Blue GC screw cap with septa | Agilent | 5190-1599 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Chloroform | Sigma | 366927 | |
Deuterium oxide | Sigma | 151882 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Merck | B1378 | |
Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Agilent | CP7419 | |
EDTA tube | Sarstedt | 411395105 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
Hexane | Merck | 34859 | |
Methanol | Merck | 34860 | |
Microcentrifuge tube | Olympus Plastic | 24-282 | |
Mouse environmental chamber | Caron | Caron 7001-33 | |
Potasium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
Potasium Phosphate | MP Biomedicals | 194727 | |
SafeLock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Screw top amber GC vial | Agilent | 5182-0716 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
Sodium Sulfate | Merck | 239313 | |
Sulfuric Acid | Merck | 258105 | |
Vial insert | Agilent | 5183-2088 |