Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio
Summary
Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.
Abstract
La síntesis de ácidos grasos es una vía metabólica compleja y altamente exigente en energía con importantes funciones en el control de la homeostasis metabólica de todo el cuerpo y otros procesos fisiológicos y patológicos. A diferencia de otras vías metabólicas clave, como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa funcionalmente de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Además, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. Aquí, describimos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases y espectrometría de masas (GCMS) para el análisis de la síntesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo. Este método mide la síntesis de los productos de la sintasa de ácidos grasos independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Se proporcionan detalles sobre la preparación de la muestra para GCMS y los cálculos posteriores. Nos centramos en el análisis de la grasa parda debido a sus altos niveles de síntesis de ácidos grasos de novo y su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.
Introduction
La obesidad y las enfermedades metabólicas asociadas son una pandemia que pone en peligro a las generaciones presentes y futuras 1,2. Comúnmente simplificada como consecuencia del desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético, la desregulación metabólica asociada a la obesidad afecta a un gran número de vías metabólicas controladas por factores ambientales y endógenos3. Sin embargo, solo unas pocas vías se prueban de forma rutinaria en modelos animales de desregulación metabólica.
A modo de ejemplo, la eliminación de glucosa se mide de forma rutinaria mediante pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina, probablemente debido a la simplicidad del uso de monitores portátiles de glucosa4. Las tasas relativas de glucosa en el cuerpo entero y de oxidación de lípidos también se estiman de forma rutinaria en función de la relación de intercambio respiratorio de los ensayos de calorimetría indirecta 5,6. Sin embargo, la mayoría de todos los demás aspectos del metabolismo no se evalúan funcionalmente de forma rutinaria. Esto conduce a interpretaciones incompletas del estado metabólico y a la pérdida de opciones terapéuticas. Una de las principales vías de este tipo es la lipogénesis de novo.
La lipogénesis de novo (DNL) es el proceso mediante el cual se generan nuevos ácidos grasos a partir de precursores. Se considera que la glucosa es el principal precursor que contribuye a la DNL7 de todo el cuerpo, sin embargo, otros precursores, como el acetato, la fructosa, el lactato y los aminoácidos de cadena ramificada, han demostrado ser fuentes de carbono relevantes de manera espacial y dependiente de la condición 8,9,10,11,12. La DNL es un contribuyente clave a la homeostasis metabólica y es esencial para el desarrollo normal13. Además, las alteraciones en la DNL se han asociado con cáncer 14,15 y metabólico 16,17,18 y enfermedades cardiovasculares 19,20.
La vía DNL está compuesta por los componentes enzimáticos centrales ATP citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC1/2) y ácidos grasos sintasa (FAS) que producen principalmente palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena impar y cadena ramificada también se pueden producir a tasas más bajas9. Las elongasas y desaturasas modifican aún más estos ácidos grasos, creando una amplia gama de especies de ácidos grasos útiles para una variedad de funciones (por ejemplo, almacenamiento de energía a largo plazo y manipulación de la fluidez de la membrana).
La expresión de la maquinaria enzimática de DNL está controlada por un número reducido de factores de transcripción. Las más descritas hasta la fecha incluyen la familia de proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP), la proteína de unión a elementos de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el receptor X hepático (LXR)21,22,23,24,25,26. A pesar de una aparente superposición en sus funciones, se han descrito regulaciones individuales basadas en la dominancia del tipo celular y en condiciones fisiológicas o patológicas21,22,27,28.
Sorprendentemente, una serie de inhibidores para pasos seleccionados de la vía DNL han sido aprobados para uso clínico o se encuentran en las etapas preclínicas o clínicas de desarrollo para una serie de enfermedades, incluida la obesidad, la enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH) y las enfermedades cardiovasculares29. Estos esfuerzos ponen de relieve la importancia de la DNL en la salud y la enfermedad.
En los últimos años, el empleo de métodos para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de ácidos grasos ha aumentado30. El método más común para evaluar esto es el uso de agua marcada pesada (D2O), donde el hidrógeno marcado pesado se incorpora a las cadenas de acilo durante la síntesis, tanto directa como indirectamente, a través del intercambio de deuterio con los hidrógenos de los sustratos DNL NAPDH, acetil-CoA y malonil-CoA. Aunque este enfoque está ganando popularidad, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. En este trabajo se describe un método para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de productos de FAS utilizando D2O y espectrometría de masas por cromatografía de gases (GCMS), con cálculos desarrollados previamente por Lee et al.31. Este método mide la síntesis de ácidos grasos de novo independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Aquí, nos centramos en el análisis del tejido adiposo marrón (BAT) debido a sus altos niveles de DNL y su papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender el equilibrio y la interacción entre vías metabólicas complejas es un paso indispensable hacia la comprensión de las bases biológicas de las enfermedades relacionadas con el metabolismo. Aquí, mostramos una metodología no invasiva y económica para determinar los cambios en la síntesis de novo de ácidos grasos. Este método es una adaptación de métodos publicados anteriormente que desarrollaron cálculos para estimar el flujo de síntesis de novo a partir del enriquecimiento de deuterio de …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Sanchez-Gurmaches y Wallace por sus valiosas discusiones. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34080527 a JSG y 19POST34380545 a RM), los NIH (R21OD031907 a JSG), un Premio del Consejo de Administración del CCHMC, un Premio del Centro de Genómica Pediátrica del CCHMC y un Premio del Centro de Genómica y Terapéutica Mendeliana del CCHMC. Este trabajo fue financiado en parte por el DK078392 P30 de los NIH del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas en Cincinnati. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. RT y MW contaron con el apoyo de una beca UCD Ad Astra.
Materials
| 4 mL Glass Vials | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| 0.2 µm filter | Olympus Plastic | 25-244 | |
| 26G needeled syringes | BD | 309597 | |
| Acetone | Merck | 34850 | |
| Acetonitrile | Merck | 900667 | |
| Blue GC screw cap with septa | Agilent | 5190-1599 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 366927 | |
| Deuterium oxide | Sigma | 151882 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Merck | B1378 | |
| Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) Select FAME Column |
Agilent | CP7419 | |
| EDTA tube | Sarstedt | 411395105 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Hexadecenoic-d31 Acid | Larodan | 71-1631 | |
| Hexane | Merck | 34859 | |
| Methanol | Merck | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Olympus Plastic | 24-282 | |
| Mouse environmental chamber | Caron | Caron 7001-33 | |
| Potasium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
| Potasium Phosphate | MP Biomedicals | 194727 | |
| SafeLock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Screw top amber GC vial | Agilent | 5182-0716 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | S5881 | |
| Sodium Phosphate, dibasic | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
| Sodium Sulfate | Merck | 239313 | |
| Sulfuric Acid | Merck | 258105 | |
| Vial insert | Agilent | 5183-2088 |
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