Quantification de la caspase-9 immunocolorée dans le tissu rétinien
Summary
Un protocole d’immunohistochimie détaillé est présenté ici pour identifier, valider et cibler les caspases fonctionnellement pertinentes dans les tissus complexes.
Abstract
La famille des caspases est connue pour arbitrer de nombreuses voies cellulaires au-delà de la mort cellulaire, y compris la différenciation cellulaire, la recherche axonale et la prolifération. Depuis l’identification de la famille des protéases de mort cellulaire, il y a eu une recherche d’outils pour identifier et élargir la fonction de membres spécifiques de la famille dans les états de développement, de santé et de maladie. Cependant, bon nombre des outils de caspase actuellement disponibles dans le commerce qui sont largement utilisés ne sont pas spécifiques pour les caspases ciblées. Dans ce rapport, nous décrivons l’approche que nous avons utilisée pour identifier, valider et cibler la caspase-9 dans le système nerveux à l’aide d’un nouvel inhibiteur et d’approches génétiques avec des lectures immunohistochimiques. Plus précisément, nous avons utilisé le tissu neuronal rétinien comme modèle pour identifier et valider la présence et la fonction des caspases. Cette approche permet l’interrogation des fonctions apoptotiques et non apoptotiques de caspase-9 spécifiques au type cellulaire et peut être appliquée à d’autres tissus complexes et caspases d’intérêt. Comprendre les fonctions des caspases peut aider à élargir les connaissances actuelles en biologie cellulaire et peut également être avantageux pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles en raison de leur implication dans la maladie.
Introduction
Les caspases sont une famille de protéases qui régulent la mort cellulaire développementale, les réponses immunitaires et la mort cellulaire aberrante dans la maladie 1,2. Bien qu’il soit bien connu que les membres de la famille des caspases sont induits dans une variété de maladies neurodégénératives, comprendre quelle caspase est à l’origine de la pathologie de la maladie est plus difficile3. De telles études nécessitent des outils pour identifier, caractériser et valider la fonction des membres individuels de la famille des caspases. L’analyse des caspases individuelles pertinentes est importante tant d’un point de vue mécaniste que thérapeutique, car la littérature contient de nombreuses études fournissant des preuves des divers rôles des caspases 4,5. Ainsi, si l’objectif est de cibler une caspase dans une maladie pour un bénéfice thérapeutique, il est essentiel d’avoir un ciblage spécifique du ou des membres de la famille concernés. Les techniques traditionnelles de détection des niveaux de caspases dans les tissus comprennent le transfert Western et les approches enzymatiques et fluorométriques 3,6. Cependant, aucune de ces mesures ne permet la détection spécifique des niveaux de caspases par les cellules et, dans certains scénarios, les caspases clivées ne peuvent souvent pas être détectées par les mesures traditionnelles d’analyse des protéines. On sait que les caspases peuvent jouer différents rôles apoptotiques et non apoptotiques dans le même tissu7, c’est pourquoi une caractérisation minutieuse des niveaux de caspases spécifiques aux cellules est nécessaire pour une compréhension précise des voies de développement et de la maladie.
Cette étude montre l’activation et la fonction des caspases dans un modèle d’hypoxie-ischémie neurovasculaire – occlusion veineuse rétinienne (OVR)7,8. Dans un tissu complexe tel que la rétine, il existe plusieurs types de cellules qui peuvent être affectées par l’hypoxie-ischémie induite dans l’OVR, y compris les cellules gliales, les neurones et le système vasculaire7. Dans la rétine de souris adulte, il y a très peu d’expression des caspases évidente dans les tissus sains, telle que mesurée par immunohistochimie (IHC)7, mais ce n’est pas le cas au cours du développement9 ou dans les modèles de maladie rétinienne10,11. L’IHC est une technique bien établie dans la recherche biomédicale qui a permis de valider des cibles pathologiques et pathologiques pathologiques et d’identifier de nouveaux rôles grâce à la localisation spatiale et de quantifier les protéines. Dans les cas où les produits de caspases clivés ne peuvent pas être détectés par transfert Western ou analyse fluorométrique, ni par l’emplacement cellulaire spécifique de caspases distinctes ou l’interrogation des voies de signalisation des caspases par localisation, alors IHC devrait être utilisé.
Afin de déterminer la ou les caspases fonctionnellement pertinentes dans l’OVR, l’IHC a été utilisée avec des anticorps validés pour les caspases et les marqueurs cellulaires. Les études précédentes réalisées en laboratoire ont montré que la caspase-9 était rapidement activée dans un modèle d’AVC ischémique et d’inhibition de la caspase-9 avec un inhibiteur hautement spécifique protégé du dysfonctionnement neuronal et de la mort12. Parce que la rétine fait partie du système nerveux central (SNC), elle sert de système modèle pour interroger et étudier plus en détail le rôle de la caspase-9 dans les lésions neurovasculaires13. À cette fin, le modèle murin de RVO a été utilisé pour étudier l’emplacement et la distribution spécifiques des cellules de la caspase-9 et son implication dans les lésions neurovasculaires. La RVO est une cause fréquente de cécité chez les adultes en âge de travailler qui résulte d’une lésion vasculaire14. Il a été constaté que la caspase-9 était exprimée de manière non apoptotique dans les cellules endothéliales, mais pas dans les neurones.
En tant que tissu, la rétine a l’avantage d’être visualisée soit comme un montage plat, ce qui permet d’apprécier les réseaux vasculaires, soit comme des coupes transversales, ce qui met en évidence les couches neuronales de la rétine. La quantification de l’expression de la protéine caspase dans les coupes transversales fournit un contexte, en ce qui concerne la caspase potentiellement critique dans la connectivité neuronale rétinienne et la fonction de vision en identifiant la localisation de la ou des caspases dans la rétine. Après identification et validation, le ciblage de la caspase d’intérêt est réalisé en utilisant la délétion spécifique de la cellule inductible de la caspase identifiée. Pour les recherches thérapeutiques potentielles, la pertinence des caspases d’intérêt a été testée à l’aide d’outils spécifiques pour inhiber les caspases activées. Pour la caspase-9, un inhibiteur hautement sélectif de la permération cellulaire 7,15, Pen1-XBIR3 a été utilisé. Aux fins du présent rapport, on a utilisé la souche mâle C57BL/6J âgée de 2 mois et la souche knockout endothéliale inductible par le tamoxifène (iEC Casp9KO) avec un fond C57BL/6J. Ces animaux ont été exposés au modèle murin de RVO et C57BL/6J ont été traités avec l’inhibiteur sélectif de la caspase-9, Pen1-XBir3. La méthodologie décrite peut être appliquée à d’autres modèles de maladie dans les systèmes central et périphérique 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les caspases sont une famille de protéases à plusieurs membres mieux étudiées pour leurs rôles dans la mort cellulaire et l’inflammation; Cependant, plus récemment, diverses fonctions non liées au décès ont été découvertes pour certains membres de la famille 4,5. Une grande partie de notre compréhension de la fonction des caspases provient de travaux en culture cellulaire et de données inférentielles sur les maladies humaines. Bien qu’il soit r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention DGE-1644869 du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) et le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) des National Institutes of Health (NIH), numéro de prix F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (à CKCO), le National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (à AMP), le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 à CMT) et le ministère de la Défense de l’armée de terre / de l’armée de l’air (DURIP à CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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