通过邻近连接和定量PCR检测酿酒酵母同源重组中间体

Summary

D环捕获（DLC）和D环延伸（DLE）测定利用邻近连接原理与定量PCR一起量化酿 酒酵母中诱导双链断裂部位的D环形成，D环延伸和产物形成。

Abstract

在细胞周期的S期和G2期发生的DNA损伤，包括DNA双链断裂和链间交联，可以通过同源重组（HR）进行修复。此外，HR是停滞或崩溃后复制分叉救援的重要机制。对这种复杂途径的许多可逆和不可逆步骤的调节促进了其保真度。对HR期间形成的重组中间体的物理分析能够通过各种核蛋白因子及其相互作用物来表征这些对照。尽管有成熟的方法来分析重组途径中的特定事件和中间体，但直到最近，检测D环形成和延伸（该途径中的两个关键步骤）已被证明具有挑战性。本文描述了检测酿酒酵母中HR途径中关键事件的有效方法，即DNA双链断裂形成，D环形成，D环延伸以及通过断裂诱导复制（BIR）形成产物。这些检测以高灵敏度检测其相关的重组中间体和产物，并且与细胞活力无关。D 环、D 环延伸和 BIR 产物的检测基于邻近连接。总之，这些测定允许在群体水平上研究HR的动力学，以精细解决HR蛋白和调节因子在途径中重要步骤的功能。

Introduction

同源重组（HR）是修复DNA双链断裂（DSB）、链间交联和ssDNA间隙的高保真机制，也是DNA损伤耐受性的途径。HR不同于容易出错的DNA损伤修复/耐受途径，例如非同源末端连接（NHEJ）和跨病变合成，因为它利用完整的同源双链DNA作为供体来模板修复事件。此外，HR途径中的许多关键中间体是可逆的，可以对各个途径步骤进行精细调节。在细胞周期的S，G2和M阶段，HR与NHEJ竞争修复两端DSB¹。此外，HR对于DNA复制至关重要，用于修复与复制相关的DNA损伤，包括ssDNA间隙和单侧DSB，以及作为DNA^损伤旁路的机制2。

HR通路中的一个关键中间体是位移环或D环（图1）。末端切除后，反应中的中心重组酶Rad51加载到新切除的破碎分子的ssDNA上，形成螺旋丝²。然后，Rad51进行同源搜索以鉴定合适的同源供体，通常是体细胞中的姐妹染色单体。当Rad51-ssDNA细丝侵入同源双链DNA时，形成D环，这导致断裂链与供体互补链的Watson-Crick碱基配对，取代相反的供体链。通过DNA聚合酶延伸断裂链的3’端，取代在DNA损伤事件中丢失的碱基，并通过合成依赖性链退火（SDSA），双霍利迪连接（dHJ）或断裂诱导复制（BIR）HR亚途径促进延伸的D环中间体分解为dsDNA产物。

物理监测HR途径中间体的测定允许分析每个步骤的遗传要求（即途径分析）。通过 Southern 印迹³，⁴，⁵，^6，7 很容易观察到 DSB 形成、末端切除、dHJ、BIR 复制气泡和 HR 产物。然而，Southern 印迹未能报告新生和扩展的 D 环，因此，需要一种可靠地测量这些关节分子的替代方法⁴，^8，9。分析新生D环形成的一种广泛使用的策略是Rad51的染色质免疫沉淀（ChIP）与定量PCR（qPCR）^10，11相结合。然而，通过 ChIP-qPCR 测量的 Rad51 与 dsDNA 的关联与序列同源性和 Rad51 附属因子 Rad54^10，11 无关。相反，使用此处介绍的D环分析方法（称为D环捕获（DLC）测定）的可观信号取决于DSB形成，序列同源性，Rad51以及Rad51辅助蛋白Rad52和Rad54⁸。酿酒酵母Rad51促进的D环形成依赖于体内Rad54的发现与许多体外重建实验一致，表明Rad54是出芽酵母Rad51⁸，¹²，^13，14，15的同源搜索和D环形成所必需的。

目前测量D环延伸的方法，主要是通过半定量PCR，也存在类似的问题。用于检测 D 环延伸的典型基于 PCR 的测定通过断裂链上同源区域上游的引物和供体链上同源区域下游的另一个引物扩增由断裂位点和异位供体供体之间的重组以及随后的重组相关 DNA 合成产生的独特序列。使用这种方法，重组相关DNA合成的检测需要非必需的Pol δ合成能力因子Pol32¹⁶。这一发现与POL32缺失对体内基因转化仅有轻微影响的观察结果相矛盾¹⁷。此外，这些基于PCR的测定无法暂时解析D环延伸和BIR产物形成，这表明信号来自dsDNA产物而不是ssDNA中间体¹⁷，^18，19。最近开发了D环延伸（DLE）测定来解决这些差异。DLE测定定量了初始3’入侵端⁹下游~400个碱基对（bp）位点的重组相关DNA合成。通过这种方法，D环延伸与Pol32无关，并且在DSB诱导后4小时内可检测到，而BIR产物在6小时首次观察到。事实上，Haber和Malkova实验室最近的一篇出版物指出，使用这种方法制备基因组DNA可以单独导致ssDNA保存^9，20。

在这里，详细介绍了DLC和DLE测定。这些测定依靠邻近连接来检测 酿酒酵母 中的新生和扩展的D环（图2）^8，9。BIR产物可以使用相同的检测系统进行定量。对于这两种测定，位于染色体（Chr.） V上 URA3 位点的HO核酸内切酶切割位点的DSB形成是由半乳糖诱导启动子控制下的HO核酸内切酶表达诱导的。Rad51介导的DNA链侵袭导致位于Chr.II上 LYS2 位点的异位供体部位形成新生的D环。由于DSB的右侧与供体缺乏同源性，因此通过SDSA和dHJ形成 进行 修复是不可行的。通过BIR对DSB进行初始修复是可能的，但是着丝粒²¹的存在抑制了活产物的形成。这种故意的设计阻止了生产性的DSB修复，从而避免了具有修复DBS的细胞恢复生长，否则可能会在时间过程分析期间超过培养物。

在DLC测定中，补骨脂素交联D环内两条异质双链DNA的补骨脂素交联保留了重组中间体。在断裂（切除）链上的限制性内切酶位点恢复和消化后，交联允许连接同源断裂和供体DNA上游的独特序列。使用qPCR，可以量化每个样品中存在的嵌合DNA分子的水平。在DLE测定中，不需要交联，限制性内切酶位点恢复和消化，然后进行分子内连接，而是将破碎分子的5’端连接到新延伸的3’端。同样，qPCR用于量化每个样品中这种嵌合产物的相对量。在没有限制性内切酶位点恢复的情况下，DLE测定报告D环延伸后形成的BIR（dsDNA）产物的相对水平。

显示了使用野生型菌株的每种测定的代表性结果，并且读者参考Piazza等人^8和Piazza等人9，以使用这些测定分析重组突变体^8，9。这项贡献的目的是使其他实验室能够采用DLC和DLE检测，并可根据要求提供支持。

Protocol

1. 预生长、DSB 诱导和样品采集 注意：建议所有培养基补充0.01%腺嘌呤用于腺苷菌株。 在酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，0.001%腺嘌呤）上划出适当的单倍体菌株（见 表1），并在30°C下生长2天。 使用单个菌落在 15 mL 玻璃培养管中接种 5 mL YPDA。将培养物培养至30°C饱和，振荡或旋转进行曝气…

Representative Results

类金刚石检测DLC测定可检测由位点特异性DSB侵入单个供体而形成的新生和扩展D环（图2）。补骨脂素交联通过D环内的异质双链DNA 物理 连接断裂的链和供体。在断裂的切除链上使用长杂交寡核苷酸进行限制性内切酶位点恢复，允许限制性内切酶切割，然后将断裂链连接到近端供体以形成通过qPCR定量的嵌合产物。值得注意的是，DLC 信号取决于补骨脂素交…

Discussion

所提供的检测方法允许使用邻近连接和qPCR检测新生和扩展的D环（DLC测定），D环延伸（DLE测定）和BIR产物形成（无杂交寡核苷酸的DLE测定）。Rad51 的 ChIP-qPCR 到远离 DSB 的位点之前已被用作 Rad51 介导的同源搜索和 D 环形成的代理。然而，该 ChIP-qPCR 信号与断裂位点和潜在供体之间的序列同源性以及 Rad51 相关因子 Rad54 无关，因此更可能代表 Rad51-ssDNA 细丝与 dsDNA 之间的瞬时关联，而不是 D 环中间体<s…

Materials

1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors