תרבית ראשונית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזירית
Summary
כאן מוצגת שיטה קלה למעקב לתרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים במבחנה .
Abstract
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאי אפיתל פיגמנטיים מקוטבים, הממוקמים בין הכורואיד לנוירוארטינה ברשתית. פונקציות מרובות, כולל פאגוציטוזיס, הובלת חומרים מזינים / מטבוליטים, מטבוליזם של ויטמין A וכו ‘, מבוצעות על ידי RPE על בסיס יומי. תאי RPE הם תאי אפיתל ממוינים עם יכולת התחדשות מועטה או ללא יכולת התחדשות. אובדן תאי RPE גורם למחלות עיניים מרובות המובילות לליקוי ראייה, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל. לכן, הקמת מודל תרבית במבחנה של תאי RPE ראשוניים, הדומה יותר ל-RPE in vivo מאשר לקווי תאים, היא קריטית למחקרים האופייניים והמכניסטיים של תאי RPE. בהתחשב בעובדה שמקור גלגלי העיניים האנושיים מוגבל, אנו יוצרים פרוטוקול לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לנתק בקלות תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים בוגרים. לאחר מכן, תאים מנותקים אלה מתחברים לתרביות/תוספות, מתרבים ליצירת מונו-שכבה מתמזגת, ומבססים מחדש במהירות תכונות מרכזיות של רקמת אפיתל in vivo תוך 2 שבועות. על ידי qRT-PCR, הוכח כי תאי RPE חזיריים ראשוניים מבטאים גנים חתימה מרובים ברמות דומות לרקמת RPE מקורית, בעוד שהביטויים של רוב הגנים הללו הולכים לאיבוד/מופחתים מאוד בתאים דמויי RPE אנושיים, ARPE-19. יתר על כן, צביעת האימונופלואורסצנציה מראה את התפלגות הצומת ההדוק, קוטביות הרקמה וחלבוני השלד, כמו גם את נוכחותו של RPE65, איזומראז חיוני לחילוף החומרים של ויטמין A, בתאים ראשוניים בתרבית. בסך הכל, פיתחנו גישה קלה למעקב לתרבית תאי RPE חזיריים ראשוניים עם טוהר גבוה ותכונות RPE מקוריות, שיכולה לשמש מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקר רעילות תאים ולהקלה על בדיקות סמים.
Introduction
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) ממוקם בין פוטורצפטורים וכוריוקפילריס בשכבה החיצונית של הרשתית1 עם פונקציות מרובות, כולל יצירת מחסום הדם-רשתית, הובלה והחלפה של חומרים מזינים ומטבוליטים ברשתית, מיחזור ויטמין A כדי לשמור על מחזור ראייה תקין, ופאגוציטוזה ופינוי של מקטעים חיצוניים של פוטורצפטור (POSs)2,3 . מכיוון שנקודות תורפה דורשות התחדשות עצמית מתמדת כדי ליצור ראייה, תאי ה-RPE צריכים לבלוע ברציפות נקודות מכירה מנותקות כדי לשמור על הומאוסטזיס רשתית4. לכן, תפקוד לקוי של RPE גורם למחלות עיניים מסנוורות רבות, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD)4, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)5, אמורוזיס מולד לבר6, רטינופתיה סוכרתית7 וכו ‘. עד כה, הפתוגנזה המדויקת של רוב המחלות הללו נותרה חמקמקה. כתוצאה מכך, תרבית תאי RPE הוקמה כדי לחקור ביולוגיה של תאי RPE, שינויים פתולוגיים ומנגנונים בסיסיים.
כמודל הפשוט ביותר לחקר הביולוגיה של התא, התרבית של תאי RPE החלה כבר בשנותה-20 של המאה ה-20. למרות ש-ARPE-19 נמצא בשימוש נרחב כתאי RPE, אובדן פיגמנטציה, מורפולוגיה מרוצפת, ובמיוחד תפקודי המחסום בקו תאים זה מעלים חששות רבים9. לשם השוואה, התרבית של תאי RPE אנושיים ראשוניים מציעה תרחיש מציאותי יותר למחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים9. עם זאת, הזמינות המוגבלת יחסית מגבילה את השימוש בהם וסוגיות אתיות קיימות תמיד. בנוסף, מספר קבוצות השתמשו במודלים של עכברים כדי לתרבת תאי RPE. עם זאת, גודל עין העכבר הוא קטן, ותרבות אחת בדרך כלל דורש עכברים רבים, וזה לא נוח9. לאחרונה, מדענים פיתחו שיטות חדשות לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים או בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים כדי להפיק תאי RPE. למרות שלטכניקה זו יש פוטנציאל מיוחד לטיפול בהפרעות RPE תורשתיות, היא גוזלת זמן ובדרך כלל דורשת מספר חודשים כדי ליצור תאי RPE בוגרים10. כדי להתגבר על בעיות אלה, כאן אנו מציגים פרוטוקול קל למעקב כדי לבודד ולתרבת תאי RPE בטוהר גבוה במעבדה באופן שגרתי. בתנאי תרבית מתאימים, תאים אלה יכולים להציג פונקציות RPE אופייניות ולהציג מורפולוגיות RPE טיפוסיות. לכן, שיטת תרבות זו יכולה לספק מודל טוב להבנת הפיזיולוגיה של RPE, לחקור ציטוטוקסיות, לחקור מנגנונים פתולוגיים של מחלות עיניים קשורות ולבצע בדיקות סמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תואר פרוטוקול מפורט וממוטב לבידוד, תרבית ואפיון של תאי RPE מגלגלי עיניים חזיריים, המייצר מודל טוב לאפיון חוץ גופי של תאי RPE ומחקרי הפרעות הקשורות ל-RPE. שיטות לבידוד ה-RPE מעיני אדם, עכבר וחולדה תוארו בעבר23,24,25. עם זאת, קשה להשיג גלגלי עי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להראות את הכרת התודה והכבוד שלהם לכל בעלי החיים שתורמים את התאים שלהם במחקר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מתוכנית המו”פ הלאומית של סין (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao ומענק מס’ 2018YFA0107301, Wei Li). המחברים מודים לג’ינגרו הואנג ושיאנג יו מהמעבדה המרכזית, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת שיאמן על התמיכה הטכנית בהדמיה קונפוקלית.
Materials
| ARPE-19 cells | CCTCC | GDC0323 | |
| Bovine serum albumin | Yeasen | 36101ES60 | |
| Confocal microscopy | Zeiss | LSM 880 with Airyscan | |
| ChemiDoc Touch | Bio-Rad | 1708370 | |
| Cell scraper | Sangon | F619301 | |
| 10 cm culture dish | NEST | 121621EH01 | |
| 12-well culture plate | NEST | 29821075P | |
| DMEM F12 Medium | Gibco | C11330500BT | |
| DMEM basic Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EVOM2 | World Precision Instruments | EVOM2 | For TER measurement |
| Fetal bovine serum | ExCell Bio | FSP500 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 0300-0108P | |
| Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP | Bio-Rad | 5196-2504 | |
| hydrocortisone | MCE | HY-N0583/CS-2226 | |
| Hoechst 33342 solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
| LightCycler 96 Instrument | Roche | 5815916001 | |
| Liothyronine | MCE | HY-A0070A/CS-4141 | |
| laminin | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | |
| MEM(1X)+GlutaMAX Medium | Gibco | 10566-016 | |
| MEM NEAA(100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Millex-GP syringe filter unit | Millipore | SLGPR33RB | |
| N1 | Sigma-Aldrich | SLCF4683 | |
| NcmECL Ultra | New Cell&Molecular Biotech | P10300 | |
| Non-fat Powdered Milk | Solarbio | D8340 | |
| Nicotinamide | SparkJade | SJ-MV0061 | |
| Na+-K+ ATPase antibody | Abcam | ab76020 | Recognize both human and porcine proteins |
| PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%) | Epizyme | PG112 | |
| primary Human RPE cells | – | – | Generous gift from Shoubi Wang lab |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Prism | GraphPad by Dotmatics | version 8.0 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | APExBIO | K1024 | |
| PRE65 antibody | Proteintech | 17939-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| PEDF antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-390172 | Recognize both human and porcine proteins |
| 100 x penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-031-1BCS | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | RARBIO | RA-9005 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | Toyobo | FSQ-201 | |
| RIPA buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 601052 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | NEST | 602052 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Taurine | Damas-beta | 107-35-7 | |
| Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | RNA extraction solution |
| TB Green Fast qPCR Mix | Takara | RR430A | |
| 12-well transwell inserts | Labselect | 14212 | |
| VEGF antibody | Proteintech | 19003-1-AP | Recognize both human and porcine proteins |
| VEGF ELISA kit | Novusbio | VAL106 | |
| ZO-1 antibody | ABclonal | A0659 | Recognize both human and porcine proteins |
References
- Tan, L. X., Germer, C. J., La Cunza, N., Lakkaraju, A. Complement activation, lipid metabolism, and mitochondrial injury: Converging pathways in age-related macular degeneration. Redox Biology. 37, 101781 (2020).
- Caceres, P. S., Rodriguez-Boulan, E. Retinal pigment epithelium polarity in health and blinding diseases. Current Opinion in Cell Biology. 62, 37-45 (2020).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Somasundaran, S., Constable, I. J., Mellough, C. B., Carvalho, L. S. Retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration: A review of major disease mechanisms. Clinical & Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1043-1056 (2020).
- Ducloyer, J. B., Le Meur, G., Cronin, T., Adjali, O., Weber, M. Gene therapy for retinitis pigmentosa. Medecine Sciences. 36 (6-7), 607-615 (2020).
- den Hollander, A. I., Roepman, R., Koenekoop, R. K., Cremers, F. P. Leber congenital amaurosis: genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 391-419 (2008).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Smith, D. T. Melanin pigment in the pigmented epithelium of the retina of the embryo chick eye studied in vivo and in vino. The Anatomical Record. 18, 260-261 (1920).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- D’Antonio-Chronowska, A., D’Antonio, M., Frazer, K. A. In vitro differentiation of human iPSC-derived retinal pigment epithelium cells (iPSC-RPE). Bio-Protocol. 9 (24), 3469 (2019).
- Hazim, R. A., Volland, S., Yen, A., Burgess, B. L., Williams, D. S. Rapid differentiation of the human RPE cell line, ARPE-19, induced by nicotinamide. Experimental Eye Research. 179, 18-24 (2019).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- . Scientific, T Available from: https://www.thermofisher.cn/document-connect/document (2022)
- . Toyota Available from: https://www.toyoboglobal.com/seihin/xr/likescience/support/manual/FSQ-201.pdf (2022)
- . Abcam Available from: https://www.abcam.cn/protocols/immunocytochemistry-immunofluorescence-protocol (2022)
- . Zeiss Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html#manuals (2022)
- . Cell Signal Technology Available from: https://www.cellsignal.cn/learn-and-support/protocols/protocol-western (2022)
- Wang, S., et al. Reversed senescence of retinal pigment epithelial cell by coculture with embryonic stem cell via the TGFbeta and PI3K pathways. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 588050 (2020).
- Pfeffer, B. A., Philp, N. J. Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue. Experimental Eye Research. 126, 1-4 (2014).
- Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future. Experimental Eye Research. 126, 5-15 (2014).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002584 (2009).
- Nita, M., Strzalka-Mrozik, B., Grzybowski, A., Mazurek, U., Romaniuk, W. Age-related macular degeneration and changes in the extracellular matrix. Medical Science Monitor. 20, 1003-1016 (2014).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Langenfeld, A., Julien, S., Schraermeyer, U. An improved method for the isolation and culture of retinal pigment epithelial cells from adult rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1493-1502 (2015).
- Sonoda, S. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
