Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Abstract

El nematodo Caenorhabditis elegans interactúa con una gran diversidad de microorganismos en la naturaleza. En general, C. elegans se encuentra comúnmente en materia vegetal podrida, especialmente frutas podridas como manzanas o en montones de compost. También se asocia con ciertos huéspedes invertebrados como y cochinillas. Estos hábitats son ricos en microbios, que sirven como alimento para C. elegans y que también pueden colonizar persistentemente el intestino del nematodo. Hasta la fecha, la diversidad exacta y la consistencia de la microbiota nativa de C. elegans en todos los hábitats y ubicaciones geográficas no se comprende completamente. Aquí, describimos un enfoque adecuado para aislar C. elegans de la naturaleza y caracterizar la microbiota de los gusanos. Los nematodos pueden aislarse fácilmente del material de compost, manzanas podridas, o atraídos colocando manzanas en montones de compost. El mejor momento para encontrar C. elegans en el hemisferio norte es de septiembre a noviembre. Los gusanos se pueden lavar del material de sustrato recolectado sumergiendo el sustrato en una solución tampón, seguido de la recolección de nematodos y su transferencia al medio de crecimiento de nematodos o tampón de PCR para su posterior análisis. Además, ilustramos cómo las muestras se pueden utilizar para aislar y purificar los microorganismos asociados al gusano y para procesar gusanos para el análisis de ARN ribosómico 16S de la composición de la comunidad de microbiota. En general, los métodos descritos pueden estimular nuevas investigaciones sobre la caracterización de la microbiota de C. elegans en hábitats y ubicaciones geográficas, ayudando así a obtener una comprensión integral de la diversidad y estabilidad de la microbiota del nematodo como base para futuras investigaciones funcionales.

Introduction

En la naturaleza, C. elegans se encuentra comúnmente en materia vegetal podrida, especialmente frutas podridas como manzanas o en montones de compost¹. También se asocia con ciertos huéspedes invertebrados como y cochinillas ^2,3. Estos hábitats son ricos en microbios, que no solo sirven como alimento para el gusano, sino que también pueden formar asociaciones estables con él. La información sobre la diversidad de microorganismos asociados naturalmente solo se publicó en 2016 ^4,5,6. Desde entonces, estos y solo unos pocos estudios más recientes han revelado que C. elegans se asocia con una variedad de bacterias y hongos, más comúnmente incluyendo bacterias del género Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter y varios otros ^6,7,8. Varias bacterias asociadas pueden colonizar de manera estable el intestino del gusano, aunque no todas 6,9,10,11,12. Es probable que sean de importancia clave para nuestra comprensión de la biología de C. elegans porque pueden proporcionar nutrición, proteger contra patógenos y posiblemente otros factores estresantes, y afectar rasgos centrales de la historia de vida, como la tasa reproductiva, el desarrollo o las respuestas conductuales.

Como ejemplo, los aislados naturalmente asociados de los géneros Pseudomonas, Ochrobactrum, y también Enterobacter o Gluconobacter pueden proteger al gusano de la infección y muerte de patógenos de distintas maneras 5,6,11,13,14. Un aislado específico del género Comamonas influye en la respuesta dietética de los nematodos, el desarrollo, la esperanza de vida y la fertilidad^15,16,17. Las bacterias de Providencia producen el neuromodulador tiramina y, por lo tanto, modulan la actividad del sistema nervioso del huésped y las respuestas conductuales resultantes¹⁸. Se demostró que un conjunto de diferentes bacterias naturalmente asociadas afectan la tasa de crecimiento de la población, la fertilidad y las respuestas conductuales 5,6,9,11,19.

Hasta la fecha, la diversidad exacta y la consistencia de la microbiota nativa de C. elegans en todos los hábitats y ubicaciones geográficas no se comprenden completamente, y aún no se han descubierto otras asociaciones entre el gusano y los microbios de su entorno. Varios estudios previos utilizaron cepas bacterianas aisladas de algún ambiente del suelo, hábitats naturales de C. elegans o de experimentos de mesocosmos (es decir, ambientes de laboratorio que recrean hábitats naturales) con cepas de laboratorio de C. elegans ^4,5,20. A pesar de que estos estudios obtuvieron nuevos conocimientos sobre la influencia de los microbios en rasgos específicos de nematodos (por ejemplo, el metabolismo de los nematodos²¹), la relevancia de estas interacciones para la biología de C. elegans en la naturaleza no está clara. Por lo tanto, este manuscrito describe los métodos para aislar directamente C. elegans de la naturaleza y para aislar y posteriormente caracterizar los microbios naturalmente asociados tanto de gusanos individuales como de grupos de gusanos. Los métodos descritos son una versión actualizada y mejorada de los procedimientos utilizados anteriormente para el aislamiento y caracterización de C. elegans natural y su microbiota nativa ^2,6,7. Teniendo en cuenta que C. elegans se encuentra ampliamente en la materia vegetal en descomposición en todo el mundo (especialmente en frutas podridas, regiones templadas y en otoño)1,2,22,23,24,25^, este protocolo puede ser aplicado por cualquier laboratorio siempre que haya interés en relacionar C. elegans rasgos a microbios naturalmente asociados y, por lo tanto, un contexto más naturalmente relevante. Este último es fundamental para una comprensión completa de la biología del nematodo porque se sabe por una diversidad de otros sistemas huéspedes que la microbiota asociada puede afectar diversas características de la historia de vida²⁶, un aspecto que actualmente se descuida en gran medida en la multitud de estudios de C. elegans en casi todas las disciplinas de ciencias de la vida.

Protocol

1. Preparación de buffers y medios Preparar el tampón S añadiendo 5,85 g de NaCl, 1,123 g de K 2 HPO 4, 5,926 g de KH2PO4 y 1 L deH2Odesionizado a un matraz y autoclave durante 20 min a 121 °C. Prepare un medio viscoso agregando tampón S que contenga 1.2% (p/v) de hidroximetilcelulosa (la sustancia que causa la viscosidad del medio), 5 mg / ml de colesterol, 1 mM de MgSO4, 1 mM de CaCl2 y 0.1% (v / v) de…

Representative Results

El nematodo C. elegans se encuentra con frecuencia en frutas en descomposición, como manzanas, y también muestras de compost. En el norte de Alemania, C. elegans, así como especies congenéricas (particularmente C. remanei pero también C. briggsae) se encuentran principalmente desde septiembre hasta el2 de noviembre. Los nematodos se encuentran más comúnmente en la materia vegetal en descomposición, especialmente en frutas podridas como manzanas o peras, …

Discussion

El nematodo Caenorhabditis elegans es uno de los organismos modelo más intensamente estudiados en la investigación biológica. Fue introducido por Sydney Brenner en la década de 1960, originalmente para comprender el desarrollo y la función del sistema nervioso²⁹. Desde entonces, C. elegans se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar procesos fundamentales en todas las disciplinas biológicas, incluida la biología del comportamiento, la neurobiología, el envejecimi…

Materials

COMSOL

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multiphysics simulation software