הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת
Summary
מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.
Abstract
יכולתם של תאים להגיב לאותות חיצוניים חיונית להתפתחות התאים, לגדילתם ולהישרדותם. כדי להגיב לאות מהסביבה, תא חייב להיות מסוגל לזהות ולעבד אותו. משימה זו מסתמכת בעיקר על תפקודם של קולטני הממברנה, שתפקידם להמיר אותות לשפה הביוכימית של התא. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה ביותר של חלבוני קולטני ממברנה בבני אדם. בקרב GPCRs, קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם תת-מחלקה ייחודית המתפקדת כדימרים מחייבים ובעלת תחום חוץ-תאי גדול המכיל את אתר קשירת הליגנד. ההתקדמות האחרונה במחקרים מבניים של mGluRs שיפרה את ההבנה של תהליך ההפעלה שלהם. עם זאת, התפשטות של שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול באמצעות mGluRs במהלך ההפעלה והמודולציה אינה מובנת היטב. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) היא טכניקה רבת עוצמה להמחשה וכימות של הדינמיקה המבנית של ביומולקולות ברמת החלבון הבודד. כדי להמחיש את התהליך הדינמי של הפעלת mGluR2, פותחו חיישנים קונפורמיים פלואורסצנטיים המבוססים על שילוב לא טבעי של חומצות אמינו (UAA) שאפשרו תיוג חלבונים ספציפיים לאתר ללא הפרעה למבנה המקומי של קולטנים. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע ניסויים אלה, כולל הגישה החדשנית לתיוג UAA, הכנת דגימות ואיסוף וניתוח נתוני smFRET. אסטרטגיות אלה ניתנות להכללה וניתן להרחיב אותן כדי לחקור את הדינמיקה הקונפורמציונית של מגוון חלבוני ממברנה.
Introduction
העברת המידע על פני קרום הפלזמה תלויה במידה רבה בתפקוד קולטני הממברנה1. קשירת ליגנד לקולטן מובילה לשינוי קונפורמציה ולהפעלת קולטן. תהליך זה הוא לעתים קרובות allosteric בטבע2. עם למעלה מ-800 חברים, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם המשפחה הגדולה ביותר של קולטני ממברנה בבני אדם3. בשל תפקידם כמעט בכל התהליכים התאיים, GPCRs הפכו ליעדים חשובים לפיתוח טיפולי. במודל הקנוני של איתות GPCR, הפעלת אגוניסט גורמת לשינויים קונפורמיים של הקולטן המפעילים לאחר מכן את קומפלקס חלבון G ההטרוטרימרי באמצעות חילופי תמ”ג עבור GTP בכיס קשירת הנוקלאוטידים שלG α. יחידות המשנה המופעלות Gα-GTP ו-Gβγ שולטות בפעילות של חלבוני אפקטים במורד הזרם ומפיצות את מפל האיתות 4,5. תהליך איתות זה תלוי למעשה ביכולתם של ליגנדים לשנות את הצורה התלת-ממדית של הקולטן. הבנה מכניסטית של האופן שבו ליגנדות משיגות זאת היא קריטית לפיתוח טיפולים חדשים ולתכנון קולטנים וחיישנים סינתטיים.
קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם חברים במשפחת ה-GPCR מדרגה C והם חשובים להשפעות הנוירומודולטוריות האיטיות של גלוטמט וכוונון הרגישות העצבית 6,7. מבין כל ה-GPCRs, GPCRs מסוג C הם ייחודיים מבחינה מבנית בכך שהם מתפקדים כדימרים מחייבים. mGluRs מכילים שלושה תחומים מבניים: תחום מלכודת הזבובים של ונוס (VFT), תחום עשיר בציסטאין (CRD) ותחום טרנס-ממברנה (TMD)8. השינויים הקונפורמיים במהלך תהליך ההפעלה הם מורכבים וכוללים צימוד קונפורמציה מקומי וגלובלי המתפשט על פני מרחק של 12 ננומטר, כמו גם שיתוף פעולה עמום. תצורות הביניים, הסדר הזמני של המצבים וקצב המעבר בין מדינות אינם ידועים. על ידי ביצוע קונפורמציה של קולטנים בודדים בזמן אמת, ניתן לזהות את מצבי הביניים החולפים ואת רצף השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה. ניתן להשיג זאת על ידי יישום העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת 9,10 (smFRET), כפי שיושם לאחרונה כדי לדמיין את התפשטות השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה של mGluR2 11. שלב מפתח בניסויי FRET הוא יצירת חיישני FRET על ידי החדרה ספציפית לאתר של התורם והמקבל פלואורופורים לחלבון המעניין. אסטרטגיית שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות (UAA) אומצה12,13,14,15 כדי להתגבר על המגבלות של טכנולוגיות תיוג פלואורסצנטיות טיפוסיות ספציפיות לאתר הדורשות יצירת מוטנטים ללא ציסטאין או החדרת תג גדול המקודד גנטית. זה איפשר את הסידור מחדש הקונפורמי של המקשר האלוסטרי הקומפקטי החיוני, שהצטרף לתחומי קשירת הליגנד והאיתות של mGluR2, כדי להיות נצפה. בפרוטוקול זה מוצג מדריך שלב אחר שלב לביצוע ניסויי smFRET ב- mGluR2, כולל הגישה לתיוג ספציפי לאתר של mGluR2 עם UAA להצמדת פלואורופורים באמצעות תגובת מחזור אזיד מזורזת נחושת. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ללכידה ישירה של חלבוני ממברנה וניתוח נתונים. הפרוטוקול המתואר כאן ישים גם לחקר הדינמיקה הקונפורמציונית של חלבוני ממברנה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
GPCRs הם חלבונים הפועלים על קרום התא כדי ליזום התמרת אותות. GPCRs רבים מורכבים ממספר תחומים, כאשר האיתות תלוי באינטראקציה השיתופית בין התחומים. כדי לווסת את המאפיינים של קולטני ממברנה אלה, חיוני להבין את ההתנהגות הדינמית של התחומים המרובים. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית חד-מולקולתית (smFRET) ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת רזא ופאבח’ש על הדיונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R01GM140272 (ל- R.V.), על ידי קרן המנהיגות של סירל למדעי החיים באוניברסיטת נורת’ווסטרן, ועל ידי הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סירל בקרן הקהילה של שיקגו (ל- R.V.). B.W.L. נתמך על ידי מענק ההדרכה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) T32GM-008061.
Materials
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
