यह पांडुलिपि गैर-इनवेसिव कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप के लिए मध्यम आकार के कैंडिडा अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करती है।
कैंडिडा अल्बिकन्स एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ है। आकृति विज्ञान रूपों के बीच स्विच करने की इसकी क्षमता इसके रोगजनन के लिए केंद्रीय है; इन आकृति विज्ञान परिवर्तनों को पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में नियंत्रित एक जटिल सिग्नलिंग नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इन नियामक घटकों का अत्यधिक अध्ययन किया गया है, लेकिन लगभग सभी अध्ययन फिलामेंटेशन को ट्रिगर करने के लिए विभिन्न प्रकार के इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग करते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि रोगजनन प्रक्रिया के दौरान मोर्फोजेनेसिस को कैसे विनियमित किया जाता है, हमने स्तनधारी मेजबान के भीतर हाइफल गठन से गुजरने वाले जीवों की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए एक इनविवो माइक्रोस्कोपी सिस्टम विकसित किया। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों के छोटे संग्रह को स्क्रीन करने के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है, जिससे हमें मॉर्फोजेनेसिस के प्रमुख नियामकों की पहचान करने की अनुमति मिलती है क्योंकि यह संक्रमण की साइट पर होता है। प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं, यह दर्शाते हुए कि मॉर्फोजेनेसिस के कुछ नियामक, जैसे कि ट्रांसक्रिप्शनल नियामक ईएफजी 1, में विट्रो और विवो में लगातार फेनोटाइप होते हैं, जबकि अन्य नियामकों, जैसे कि एडेनिल साइक्लेज (साइर 1) में इन विट्रो की तुलना में विवो में काफी अलग फेनोटाइप होते हैं।
कैंडिडा अल्बिकन्स एक आम मानव कवक रोगज़नक़ है, जिससे म्यूकोक्यूटेनियस रोग, प्रसारित रोग और स्थानीय ऊतक संक्रमणहोता है। अल्बिकन्स फिजियोलॉजी की एक प्रमुख विशेषता इसकी जटिल बहुरूपी वृद्धि है, जो एक कॉमेंसल और एक रोगज़नक़ 2,3,4 दोनों के रूप में इसकी भूमिका से जुड़ी हुई है। 30 डिग्री सेल्सियस पर विट्रो में समृद्ध पोषक तत्वों की स्थिति के तहत, यह आमतौर पर एक ओवॉइड नवोदित खमीर के रूप में बढ़ता है। पोषक तत्वों की कमी, पीएच परिवर्तन, 37 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि, सीरम के संपर्क में, और अगर में एम्बेडेड होने पर विकास सहित विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय ट्रिगर्स के परिणामस्वरूप ध्रुवीकृत विकास पैटर्न में संक्रमण होता है, जिसके परिणामस्वरूप सच्चे हाइफे और / या स्यूडोहिफे5 का गठन होता है। ध्रुवीकृत विकास की शुरुआत और फिलामेंटस जीवों के परिणामस्वरूप विकास को मोर्फोजेनेसिस के रूप में जाना जाता है।
जीव की उग्रता में मोर्फोजेनेसिस के महत्व के कारण, हाइफल गठन के विनियमन का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है 6,7. सिग्नलिंग मार्गों और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एक जटिल नेटवर्क है जो मॉर्फोजेनेसिस को ट्रिगर करता है। रोगजनन के साथ सी अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस के संबंध के बावजूद, मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययनों ने हाइफल गठन को ट्रिगर करने के लिए इन विट्रो उत्तेजनाओं का उपयोग किया है। यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि फिलामेंटेशन के विभिन्न इन विट्रो मॉडल उत्तेजित व्यक्तिगत नियामक मार्गों के संदर्भ में समान नहीं हैं। इसके अलावा, कोई भी इन विट्रो विकास की स्थिति मेजबान के जटिल वातावरण के साथ कसकर मेल नहीं खाती है। मानव रोगज़नक़ के रूप में सी अल्बिकन्स के महत्व को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मध्यम थ्रूपुट वाली प्रणाली का उपयोग करके स्तनधारी मेजबान में सक्रिय संक्रमण के दौरान इसके मोर्फोजेनेसिस की जांच करना है, इस प्रकार एक अन्वेषक को सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की जांच करने की अनुमति मिलती है।
इन जांचों को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक इनविवो इमेजिंग सिस्टम विकसित किया गया था जो हमें उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप 8,9,10 का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस के पिन्ना के संक्रमण के दौरान सी अल्बिकन्स कोशिकाओं की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है। क्योंकि पिन्ना की त्वचा काफी पतली है, इन छवियों को ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता के बिना प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रकार, मात्रात्मक फेनोटाइप डेटा को मेजबान ऊतक के भीतर सक्रिय संक्रमण की साइट पर मापा जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति कैसेट11,12 के साथ एक संदर्भ तनाव और एक या अधिक उत्परिवर्ती उपभेदों का परिवर्तन शामिल है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त उपभेदों को तब मिश्रित किया जाता है और इंट्राडर्मल रूप से सह-इंजेक्शन दिया जाता है। संक्रमण स्थापित होने के बाद, कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग फिलामेंटेशन की आवृत्ति और गठित फिलामेंट्स की लंबाई दोनों को मापने के लिए किया जाता है। उत्परिवर्ती उपभेदों से प्राप्त डेटा को संदर्भ तनाव से प्राप्त किया जाता है, जो एक ही ऊतक क्षेत्र में मौजूद होता है, इस प्रकार एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है। इस प्रणाली ने हमें सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों की कई श्रृंखलाओं को सफलतापूर्वक स्क्रीन करने की अनुमति दी है, जिनमें से कई में विट्रो 9,10 में मॉर्फोजेनेसिस दोष हैं। इनमें से कई उपभेदों में विवो में आसानी से फिलामेंट होता है, जो मोर्फोजेनेसिस की जांच के लिए विवो मॉडल के महत्व पर प्रकाश डालता है।
अल्बिकन्स जीवों की छवियों को प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है क्योंकि वे स्तनधारी मेजबान के ऊतक के भीतर बढ़ते हैं, इस प्रकार हमें सक्रिय संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस फेनोटाइप का मूल्यांकन करने की अनुमति मिलती है। अल्बिकन्स रोगजनन के लिए मॉर्फोजेनेसिस की प्रक्रिया केंद्रीय है और विभिन्न प्रकार के इन विट्रो परख 2,3,4 का उपयोग करके व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। हालांकि, कोई भी इन विट्रो परख मेजबान के जटिल जैव रासायनिक और संरचनात्मक वातावरण को पूरी तरह से मॉडल नहीं कर सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल संक्रमण के दौरान मॉर्फोजेनेसिस में शामिल जीन की पहचान करने के लिए सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती की एक श्रृंखला / पुस्तकालय को स्क्रीन करने के लिए विवो इमेजिंग सिस्टम में इसके उपयोग पर केंद्रित है। विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करने वाले सी अल्बिकन्स उपभेदों का उपयोग हमें संदर्भ तनाव की तुलना में सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती उपभेदों के विवो मोर्फोजेनेसिस में मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। संक्रमण के एक ही क्षेत्र के भीतर संदर्भ तनाव के लिए उत्परिवर्ती में मोर्फोजेनेसिस की तुलना यह सुनिश्चित करती है कि जीव समान वातावरण के संपर्क में हैं। यह फिलामेंटेशन से गुजरने वाली कोशिकाओं के प्रतिशत के मात्रात्मक माप के साथ-साथ फिलामेंटेशन की सीमा के लिए अनुमति देता है। संदर्भ तनाव के लिए उत्परिवर्ती तनाव (ओं) के माप का सामान्यीकरण हमें एक उत्परिवर्ती के प्रदर्शन की दूसरे में बेहतर तुलना करने की अनुमति देता है।
यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो और विवो फेनोटाइप्स के बीच एक महत्वपूर्ण विसंगति की क्षमता प्रदर्शित करते हैं। अल्बिकन्स ईएफजी 1एओ म्यूटेंट स्ट्रेन का उपयोग अक्सर मॉर्फोजेनेसिस परख के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है क्योंकि यह लगभग सभी इन विट्रो स्थितियों में फिलामेंट करने में विफल रहता है। यद्यपि विवो के परिणाम इन विट्रो परिणामों के समान थे, यहां तक कि इस गंभीर रूप से बाधित तनाव ने कभी-कभी मेजबान ऊतक वातावरण में फिलामेंट्स का निर्माण किया (चित्रा 3)। यह मॉर्फोजेनेसिस को ट्रिगर करने में मेजबान वातावरण की ताकत पर जोर देता है।
इसके विपरीत, साइर 1एओ म्यूटेंट स्ट्रेन इन विट्रो और विवो विकास के बीच पर्याप्त मतभेद को दर्शाता है; यद्यपि उत्परिवर्ती कोशिकाओं में से कोई भी विट्रो में फिलामेंटेशन से नहीं गुजरता है, लगभग आधी कोशिकाएं विवो (चित्रा 4)10,21 में फिलामेंट्स के रूप में बढ़ती हैं। दिलचस्प बात यह है कि ये फिलामेंट्स संदर्भ तनाव द्वारा गठित लोगों की तुलना में काफी कम थे, यह सुझाव देते हुए कि CYR1 या तो फिलामेंट विकास की दर या फिलामेंटस फेनोटाइप को बनाए रखने की क्षमता में योगदान देता है। फिलामेंट लंबाई के विश्लेषण की सुविधा के लिए, फिलामेंट्स की वक्र पथ लंबाई को छवियों के दो-आयामी प्रक्षेपण का उपयोग करके मापा गया था। तीन आयामों में बढ़ने वाले फिलामेंट्स के दो-आयामी अनुमानों में, एक अक्ष पर बढ़ने वाला कोई भी फिलामेंट जो xy विमान के समानांतर नहीं है, इसकी वास्तविक लंबाई से कम के रूप में प्रोजेक्ट करेगा। जैसा कि संदर्भ तनाव के लिए यह फोरशॉर्टिंग भी होती है, दो-आयामी प्रक्षेपण में फिलामेंट लंबाई के वितरण का मूल्यांकन अभी भी संदर्भ और उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच मात्रात्मक तुलना की अनुमति देता है। तीन आयामों के बजाय दो में फिलामेंट लंबाई के विश्लेषण के लिए कम गहन छवि विश्लेषण की आवश्यकता होती है; इस प्रकार, यह एक विशिष्ट डेस्कटॉप कंप्यूटर पर अपेक्षाकृत जल्दी से किया जा सकता है। इस सरल विश्लेषण का उपयोग करने से एक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में फिलामेंट लंबाई वितरण को शामिल करने की अनुमति मिलती है, जिससे थ्रूपुट में पर्याप्त देरी के बिना मोर्फोजेनेसिस से गुजरने के लिए प्रत्येक उत्परिवर्ती की क्षमता की अधिक बारीक समझ मिलती है।
यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि अध्ययन डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग करके किए गए थे, जिनके पूरक प्रणाली में दोष है जिससे सी अल्बिकन्स संक्रमण22 की साइट पर न्यूट्रोफिल की भर्ती करने में विफलता होती है। इन अध्ययनों का लक्ष्य मेजबान ऊतक के भीतर सी अल्बिकन्स फिलामेंटेशन के विनियमन के तंत्र की जांच करना था। इसलिए डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग एक व्यक्तिगत तनाव की संवेदनशीलता या न्यूट्रोफिल के प्रतिरोध के कारण परिणामों को भ्रमित करने से बचने के लिए किया गया था। चूंकि न्यूट्रोफिल एंटी-सी अल्बिकन्स प्रतिक्रिया फिलामेंटेशन23 को प्रभावित कर सकती है, संक्रमण की साइट पर न्यूट्रोफिल भर्ती एक मॉर्फोजेनेसिस परख के परिणामों को प्रभावित कर सकती है। यदि एक तनाव विवो में फिलामेंटिंग करने में सक्षम है, लेकिन न्यूट्रोफिल मौजूद होने पर फिलामेंटेशन से दृढ़ता से बाधित होता है, तो डीबीए 2 / एन चूहों में फिलामेंटेशन का पता लगाया जाएगा, लेकिन बरकरार न्यूट्रोफिल केमोटैक्सिस वाले चूहों का उपयोग करते समय देखा जाने की संभावना नहीं होगी। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय मेजबान के रूप में उपयोग किए जाने वाले माउस का तनाव एक महत्वपूर्ण कारक है।
यह अवलोकन कि efg1ΔE उत्परिवर्ती तनाव विवो में फिलामेंट करने में विफल रहता है, मेजबान न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं से संबंधित होने की संभावना नहीं है, क्योंकि यह तनाव विट्रो में फिलामेंट करने में भी विफल रहता है। विवो में साइर1एओस्ट्रेन के साथ देखा गया फिलामेंटेशन विट्रो में फिलामेंटेशन में विफलता के साथ अलग है। अल्बिकन्स संक्रमण के ज़ेब्राफिश मॉडल के डेटा से संकेत मिलता है कि मॉर्फोजेनेसिस24 की रोकथाम में न्यूट्रोफिल का जवाब देना महत्वपूर्ण है। इसलिए, डीबीए 2 / एन चूहों का उपयोग, जिनमें न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं की कमी होती है, इन विट्रो की तुलना में विवो में साइर 1ए के फिलामेंटेशन में वृद्धि के लिए जिम्मेदार होने की संभावना नहीं है। फिर भी, विवो वातावरण स्पष्ट रूप से Cyr1E3तनाव के मोर्फोजेनेसिस को प्रभावित कर रहा है; इस प्रकार, इस तनाव की आगे की जांच सक्रिय संक्रमण के दौरान सी अल्बिकन्स मॉर्फोजेनेसिस के विनियमन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को भविष्य के अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले Cyr1E34स्ट्रेन जैसे उपभेदों की पहचान करने के लिए एक स्क्रीनिंग परख के रूप में डिज़ाइन किया गया है।
कम प्रवाह गैस संज्ञाहरण प्रणाली का उपयोग इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए, बी) के लिए बहुत उपयोगी है। इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक विकास के दौरान, चूहों को जाइलाज़िन के साथ मिश्रित केटामाइन के इंजेक्शन एनेस्थेटिक कॉकटेल का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड किया गया था। हालांकि उस एनेस्थेटिक विधि के साथ सीमित इमेजिंग करना संभव था, संज्ञाहरण की अवधि अप्रत्याशित थी, इमेजिंग के दौरान एनेस्थीसिया से ठीक होने वाले माउस से बचने के लिए इमेजिंग सत्रों को जल्दी से समाप्त करने की आवश्यकता थी। पारंपरिक साँस लेने वाले एनेस्थेटिक सिस्टम भारी होते हैं और एनेस्थेटिक गैसों के प्रवाह की उच्च दर की आवश्यकता होती है, अक्सर उन्हें फ्यूम हुड के भीतर उपयोग करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, पारंपरिक इनहेल्ड एनेस्थेटिक सिस्टम को अनजाने में जांचकर्ताओं को एनेस्थेटिक एजेंटों के संपर्क में लाए बिना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की अंतरिक्ष बाधाओं के साथ उपयोग करना बहुत मुश्किल होगा। कम प्रवाह वाले एनेस्थेटिक सिस्टम का उपयोग अन्वेषक के लिए एक सुरक्षित वातावरण बनाए रखते हुए जानवर के लगातार संज्ञाहरण की अनुमति देता है। कम प्रवाह वाला नोजकोन टीकाकरण और माइक्रोस्कोपी दोनों के लिए जानवर की आसान स्थिति की अनुमति देता है। छोटे-कैलिबर, कम मात्रा वाले वितरण ट्यूबिंग अपेक्षाकृत लंबी ट्यूबों के उपयोग की अनुमति देता है, जो संज्ञाहरण मशीन को पर्याप्त दूरी पर रखने में सक्षम बनाता है ताकि माइक्रोस्कोपी में हस्तक्षेप न हो।
विशिष्ट माउस चाउ में मौजूद क्लोरोफिल महत्वपूर्ण ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस25 की ओर जाता है। यह छवियों में पर्याप्त शोर पैदा करता है, जिससे उच्च गुणवत्ता वाले, उच्च-स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। जब जानवरों को इमेजिंग से पहले 7 दिनों के लिए क्लोरोफिल-मुक्त चाउ खिलाया गया था, तो ऑटोफ्लोरेसेंस से पृष्ठभूमि ऊतक में काफी कम हो गई थी, लेकिन बालों में जमा क्लोरोफिल समस्याग्रस्त बना रहा। ओवर-द-काउंटर रासायनिक डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके पिने पर बालों को हटाना बालों में ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने में प्रभावी है (चित्रा 1 सी, डी)। इस प्रकार, क्लोरोफिल-मुक्त चाउ और पर्याप्त बाल हटाने के संयोजन ने ऑटोफ्लोरेसेंस को काफी हद तक कम कर दिया और नाटकीय रूप से छवि की गुणवत्ता में सुधार किया। क्योंकि इमेजिंग से पहले बालों को कान से हटा दिया जाता है, जानवर के बालों का रंग इस प्रणाली को प्रभावित नहीं करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग बीएएलबी /सी (सफेद), सी 57बीएल / 6 (काला), और डीबीए 2 / एन (भूरे) चूहों में सी अल्बिकन्स संक्रमण का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। प्रोटोकॉल का उपयोग सी 57बीएल / 6 नॉकआउट चूहों के साथ भी किया जा सकता है जो विभिन्न मेजबान जीनों में कमी रखते हैं; यह भविष्य की जांच की अनुमति देगा कि स्तनधारी मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली फिलामेंटेशन को कैसे प्रभावित करती है। इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं की गई इस मॉडल की एक विशेषता यह है कि, क्योंकि यह इमेजिंग सिस्टम गैर-इनवेसिव है, एक ही जानवर को कई दिनों में बार-बार चित्रित किया जा सकता है, जिससे समय के साथ व्यक्तिगत संक्रमण की प्रगति का पालन करने की अनुमति मिलती है। यह सुविधा मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत पर भविष्य के अध्ययनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगी।
सारांश में, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप एक जीवित स्तनधारी मेजबान के ऊतक में बढ़ने वाले सी अल्बिकन्स की उच्च-स्थानिक रिज़ॉल्यूशन छवियां होती हैं, जिससे उत्परिवर्ती उपभेदों 8,9,10 में मॉर्फोजेनेसिस के सटीक मूल्यांकन की अनुमति मिलती है। यहां प्रस्तुत परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी अल्बिकन्स उत्परिवर्ती की लाइब्रेरी को स्क्रीन करने के लिए कैसे किया जा सकता है। अल्बिकन्स उत्परिवर्ती का आज तक परीक्षण किया गया है, विट्रो में मॉर्फोजेनेसिस में ज्ञात दोषों वाले उत्परिवर्ती का एक बड़ा हिस्सा आसानी से विवो 9,10 में फिलामेंटेशन से गुजरता है। यह सी अल्बिकन्स रोगजनन के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों में इस तरह के विवो सिस्टम को शामिल करने के महत्व पर प्रकाश डालता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईएच अनुदान 1आर01एआई 33409 और बाल रोग विभाग, कार्वर कॉलेज ऑफ मेडिसिन, आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
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Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |