Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Summary
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.
Abstract
La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché. Par conséquent, l’utilisation de modèles précliniques appropriés d’évaluation de la sécurité cardiaque est une étape cruciale lors de la mise au point de médicaments. À l’heure actuelle, l’évaluation de l’innocuité cardiaque dépend encore fortement des études sur les animaux. Cependant, les modèles animaux sont en proie à une faible spécificité translationnelle pour les humains en raison de différences spécifiques à l’espèce, en particulier en termes de caractéristiques électrophysiologiques cardiaques. Il est donc urgent de développer un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque. Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro inestimable pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Les hiPSC-CM peuvent être obtenus à partir d’individus ayant divers antécédents génétiques et diverses maladies pathogènes, ce qui en fait un substitut idéal pour évaluer individuellement la cardiotoxicité induite par les médicaments. Par conséquent, il est nécessaire d’établir des méthodologies permettant d’étudier de manière exhaustive les caractéristiques fonctionnelles des CM-CSPh. Dans ce protocole, nous détaillons divers tests fonctionnels qui peuvent être évalués sur les CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium. Dans l’ensemble, l’intégration des CSPhi-CM dans l’évaluation préclinique de l’innocuité cardiaque a le potentiel de révolutionner le développement de médicaments.
Introduction
Le développement de médicaments est un processus long et coûteux. Une étude sur les nouveaux médicaments thérapeutiques approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis entre 2009 et 2018 a révélé que le coût médian estimé de la recherche et des essais cliniques capitalisés était de 985 millions de dollars par produit1. La cardiotoxicité induite par les médicaments est la principale cause d’attrition des médicaments et de retrait du marché2. Notamment, la cardiotoxicité est signalée parmi plusieurs classes de médicaments thérapeutiques3. Par conséquent, l’évaluation de la sécurité cardiaque est un élément crucial du processus de développement du médicament. Le paradigme actuel de l’évaluation de la sécurité cardiaque dépend encore fortement des modèles animaux. Cependant, les différences entre les espèces par rapport à l’utilisation de modèles animaux sont de plus en plus reconnues comme la principale cause des prédictions inexactes de la cardiotoxicité induite par les médicaments chez les patients humains4. Par exemple, la morphologie du potentiel d’action cardiaque diffère considérablement entre les humains et les souris en raison des contributions de différents courants repolarisants5. De plus, les isoformes différentielles de myosine cardiaque et d’ARN circulaires qui peuvent avoir un impact sur la physiologie cardiaque ont été bien documentées chez les espèces 6,7. Pour combler ces lacunes, il est impératif d’établir un modèle fiable, efficace et humain pour l’évaluation préclinique de la sécurité cardiaque.
L’invention révolutionnaire de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a généré des plateformes sans précédent de dépistage de médicaments et de modélisation des maladies. Au cours de la dernière décennie, les méthodes de génération de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont devenues bien établies 8,9. Les hiPSC-CM ont suscité un grand intérêt pour leurs applications potentielles dans la modélisation des maladies, le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la médecine de précision. Par exemple, les hiPSC-CM ont été utilisés pour modéliser les phénotypes pathologiques des maladies cardiaques causées par l’hérédité génétique, telles que le syndrome du QT long10, la cardiomyopathie hypertrophique 11,12 et la cardiomyopathie dilatée13,14,15. Par conséquent, des voies de signalisation clés impliquées dans la pathogenèse des maladies cardiaques ont été identifiées, ce qui peut éclairer les stratégies thérapeutiques potentielles pour un traitement efficace. De plus, les hiPSC-CM ont été utilisés pour dépister la cardiotoxicité induite par les médicaments associée aux agents anticancéreux, y compris la doxorubicine, le trastuzumab et les inhibiteurs de la tyrosine kinase16,17,18; Des stratégies visant à atténuer la cardiotoxicité qui en résulte sont à l’étude. Enfin, l’information génétique conservée dans les CSPhi-CM permet le dépistage et la prédiction de la cardiotoxicité induite par les médicaments aux niveaux individuel et de la population19,20. Collectivement, les hiPSC-CM se sont révélés être un outil inestimable pour la prédiction personnalisée de la sécurité cardiaque.
L’objectif global de ce protocole est d’établir des méthodologies pour étudier de manière exhaustive et efficace les caractéristiques fonctionnelles des CSPh-CM, qui sont d’une grande importance dans l’application des CSPhi-CM à la modélisation de la maladie, au dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et à la médecine de précision. Ici, nous détaillons une série de tests fonctionnels pour évaluer les propriétés fonctionnelles des CM-HiPSC, y compris la mesure de la contractilité, du potentiel de champ, du potentiel d’action et de la manipulation du calcium (Ca2+) (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La technologie iPSC humaine est devenue une plate-forme puissante pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour mesurer la contractilité hiPSC-CM, le potentiel de champ, le potentiel d’action et le transitoire Ca2+. Ce protocole fournit une caractérisation complète de la contractilité et de l’électrophysiologie hiPSC-CM. Ces tests fonctionnels ont été appliqués dans plusieurs publications de notre groupe 12,13,18,24,25,26,27….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Blake Wu d’avoir relu le manuscrit. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, et NASA NNX16A069A (JCW), et AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
