मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स पर माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के तकनीकी अनुप्रयोग
Summary
मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग के लिए एक आशाजनक इन विट्रो मॉडल के रूप में उभरे हैं। यहां, हम एचआईपीएससी-सीएम की अनुबंध और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं।
Abstract
दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी दवा एट्रिशन और बाजार से वापसी का प्रमुख कारण है। इसलिए, दवा के विकास के दौरान उचित प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन मॉडल का उपयोग करना एक महत्वपूर्ण कदम है। वर्तमान में, हृदय सुरक्षा मूल्यांकन अभी भी पशु अध्ययन पर अत्यधिक निर्भर है। हालांकि, पशु मॉडल प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों के कारण मनुष्यों के लिए खराब ट्रांसलेशनल विशिष्टता से ग्रस्त हैं, विशेष रूप से कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं के संदर्भ में। इस प्रकार, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और मानव-आधारित मॉडल विकसित करने की तत्काल आवश्यकता है। मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग के लिए एक अमूल्य इन विट्रो मॉडल के रूप में उभरे हैं। HIPSC-CM को विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और विभिन्न रोगग्रस्त स्थितियों वाले व्यक्तियों से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे उन्हें व्यक्तिगत रूप से दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए एक आदर्श सरोगेट बनाया जा सकता है। इसलिए, एचआईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक विशेषताओं की व्यापक जांच करने के लिए कार्यप्रणाली स्थापित करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न कार्यात्मक परखों का विस्तार करते हैं जिनका मूल्यांकन एचआईपीएससी-सीएम पर किया जा सकता है, जिसमें अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम हैंडलिंग का माप शामिल है। कुल मिलाकर, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन में एचआईपीएससी-सीएम को शामिल करने से दवा के विकास में क्रांति लाने की क्षमता है।
Introduction
दवा विकास एक लंबी और महंगी प्रक्रिया है। 2009 और 2018 के बीच यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित नई चिकित्सीय दवाओं के एक अध्ययन ने बताया कि पूंजीकृत अनुसंधान और नैदानिक परीक्षणों की अनुमानित औसत लागत $ 985 मिलियन प्रति उत्पाद1 थी। दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटीदवा एट्रिशन और बाजार से वापसी का प्रमुख कारण है। विशेष रूप से, कार्डियोटॉक्सिसिटी चिकित्सीय दवाओंके कई वर्गों के बीच रिपोर्ट की जाती है। इसलिए, दवा विकास प्रक्रिया के दौरान हृदय सुरक्षा मूल्यांकन एक महत्वपूर्ण घटक है। हृदय सुरक्षा मूल्यांकन के लिए वर्तमान प्रतिमान अभी भी पशु मॉडल पर अत्यधिक निर्भर है। हालांकि, पशु मॉडल के उपयोग से प्रजातियों के अंतर को मानव रोगियों में दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी के लिए गलत भविष्यवाणियों के प्राथमिक कारण के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्तहै। उदाहरण के लिए, हृदय क्रिया क्षमता की आकृति विज्ञान विभिन्न पुनर्ध्रुवीकरण धाराओंके योगदान के कारण मनुष्यों और चूहों के बीच काफी भिन्न होता है। इसके अलावा, कार्डियक मायोसिन और सर्कुलर आरएनए के अंतर आइसोफॉर्म जो कार्डियक फिजियोलॉजी को प्रभावित कर सकते हैं, प्रजातियों 6,7 के बीच अच्छी तरह से प्रलेखित किए गए हैं। इन अंतरालों को पाटने के लिए, प्रीक्लिनिकल कार्डियक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय, कुशल और मानव-आधारित मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है।
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) तकनीक के अभूतपूर्व आविष्कार ने अभूतपूर्व दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग प्लेटफॉर्म उत्पन्न किए हैं। पिछले एक दशक में, मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (HIPSC-CMs) उत्पन्न करने के तरीके अच्छी तरहसे स्थापित हो गए हैं। HIPSC-CM ने रोग मॉडलिंग, दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और सटीक चिकित्सा में अपने संभावित अनुप्रयोगों में बहुत रुचि आकर्षित की है। उदाहरण के लिए, एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग आनुवंशिक वंशानुक्रम के कारण हृदय रोगों के पैथोलॉजिकल फेनोटाइप को मॉडल करने के लिए किया गया है, जैसे कि लंबे क्यूटी सिंड्रोम10, हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी 11,12, और पतला कार्डियोमायोपैथी 13,14,15। नतीजतन, हृदय रोगों के रोगजनन में निहित प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों की पहचान की गई है, जो प्रभावी उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय रणनीतियों पर प्रकाश डाल सकते हैं। इसके अलावा, एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग एंटीकैंसर एजेंटों से जुड़े दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी को स्क्रीन करने के लिए किया गया है, जिसमें डॉक्सोर्यूबिसिन, ट्रास्टुज़ुमाब और टायरोसिन किनेज इनहिबिटर 16,17,18 शामिल हैं; परिणामी कार्डियोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए रणनीतियों की जांच की जा रही है। अंत में, एचआईपीएससी-सीएम में रखी गई आनुवंशिक जानकारी व्यक्तिगत और जनसंख्या स्तर19,20 दोनों पर दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी की स्क्रीनिंग और भविष्यवाणी की अनुमति देती है। सामूहिक रूप से, HIPSC-CM व्यक्तिगत हृदय सुरक्षा भविष्यवाणी के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हुए हैं।
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एचआईपीएससी-सीएम की कार्यात्मक विशेषताओं की व्यापक और कुशलतापूर्वक जांच करने के लिए कार्यप्रणाली स्थापित करना है, जो रोग मॉडलिंग, दवा-प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी स्क्रीनिंग और सटीक चिकित्सा की ओर एचआईपीएससी-सीएम को लागू करने में बहुत महत्वपूर्ण हैं। यहां, हम HIPSC-CM के कार्यात्मक गुणों का आकलन करने के लिए कार्यात्मक परखों की एक सरणी का विस्तार करते हैं, जिसमें अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम (Ca2+) हैंडलिंग (चित्रा 1) की माप शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव आईपीएससी प्रौद्योगिकी रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में उभरी है। यहां, हम HIPSC-CM अनुबंध, क्षेत्र क्षमता, कार्रवाई क्षमता और Ca2+ क्षणिक को मापने के लिए एक विस्तृत प्रो…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग करने के लिए ब्लेक वू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01 एचएल113006, आर01 एचएल141371, आर01 एचएल163680, आर01 एचएल141851, यू01एफडी005978, और नासा एनएनएक्स16ए069ए (जेसीडब्ल्यू), और एएचए पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप 872244 (जीएमपी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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