Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane
Summary
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall’uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l’elettrofisiologia delle hiPSC-CM.
Abstract
La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato. Pertanto, l’utilizzo di appropriati modelli di valutazione della sicurezza cardiaca preclinica è un passo fondamentale durante lo sviluppo del farmaco. Attualmente, la valutazione della sicurezza cardiaca dipende ancora fortemente dagli studi sugli animali. Tuttavia, i modelli animali sono afflitti da scarsa specificità traslazionale per gli esseri umani a causa delle differenze specie-specifiche, in particolare in termini di caratteristiche elettrofisiologiche cardiache. Pertanto, vi è l’urgente necessità di sviluppare un modello affidabile, efficiente e basato sull’uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca. I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall’uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un prezioso modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Gli hiPSC-CM possono essere ottenuti da individui con diversi background genetici e varie condizioni patologiche, rendendoli un surrogato ideale per valutare individualmente la cardiotossicità indotta da farmaci. Pertanto, è necessario stabilire metodologie per studiare in modo completo le caratteristiche funzionali delle hiPSC-CM. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio vari saggi funzionali che possono essere valutati su hiPSC-CM, tra cui la misurazione della contrattilità, del potenziale di campo, del potenziale d’azione e della manipolazione del calcio. Nel complesso, l’incorporazione di hiPSC-CM nella valutazione preclinica della sicurezza cardiaca ha il potenziale per rivoluzionare lo sviluppo di farmaci.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci è un processo lungo e costoso. Uno studio su nuovi farmaci terapeutici approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti tra il 2009 e il 2018 ha riportato che il costo medio stimato della ricerca capitalizzata e degli studi clinici è stato di $ 985 milioni per prodotto1. La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato2. In particolare, la cardiotossicità è riportata tra più classi di farmaci terapeutici3. Pertanto, la valutazione della sicurezza cardiaca è una componente cruciale durante il processo di sviluppo del farmaco. L’attuale paradigma per la valutazione della sicurezza cardiaca dipende ancora fortemente dai modelli animali. Tuttavia, le differenze di specie rispetto all’uso di modelli animali sono sempre più riconosciute come causa primaria di previsioni imprecise per la cardiotossicità indotta da farmaci nei pazienti umani4. Ad esempio, la morfologia del potenziale d’azione cardiaco differisce sostanzialmente tra esseri umani e topi a causa dei contributi di diverse correnti ripolarizzanti5. Inoltre, isoforme differenziali di miosina cardiaca e RNA circolari che possono avere un impatto sulla fisiologia cardiaca sono state ben documentate tra le specie 6,7. Per colmare queste lacune, è imperativo stabilire un modello affidabile, efficiente e basato sull’uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca.
L’invenzione rivoluzionaria della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha generato piattaforme di screening farmacologico e di modellazione delle malattie senza precedenti. Negli ultimi dieci anni, i metodi per generare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC-CMs) sono diventati ben consolidati 8,9. Le hiPSC-CM hanno suscitato grande interesse nelle loro potenziali applicazioni nella modellizzazione delle malattie, nello screening cardiotossicologico indotto da farmaci e nella medicina di precisione. Ad esempio, le hiPSC-CM sono state utilizzate per modellare i fenotipi patologici delle malattie cardiache causate dall’eredità genetica, come la sindrome del QT lungo10, la cardiomiopatia ipertrofica 11,12 e la cardiomiopatia dilatativa13,14,15. Di conseguenza, sono state identificate le principali vie di segnalazione implicate nella patogenesi delle malattie cardiache, che possono far luce su potenziali strategie terapeutiche per un trattamento efficace. Inoltre, le hiPSC-CM sono state utilizzate per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci associata ad agenti antitumorali, tra cui doxorubicina, trastuzumab e inibitori della tirosin-chinasi16,17,18; Sono allo studio strategie per mitigare la cardiotossicità risultante. Infine, le informazioni genetiche conservate nelle hiPSC-CM consentono lo screening e la previsione della cardiotossicità indotta da farmaci sia a livello individuale che di popolazione19,20. Collettivamente, le hiPSC-CM hanno dimostrato di essere uno strumento inestimabile per la previsione personalizzata della sicurezza cardiaca.
L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire metodologie per studiare in modo completo ed efficiente le caratteristiche funzionali delle hiPSC-CM, che sono di grande importanza nell’applicazione delle hiPSC-CM verso la modellizzazione della malattia, lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la medicina di precisione. Qui, descriviamo in dettaglio una serie di saggi funzionali per valutare le proprietà funzionali delle hiPSC-CM, tra cui la misurazione della contrattilità, del potenziale di campo, del potenziale d’azione e della manipolazione del calcio (Ca2+) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnologia iPSC umana è emersa come una potente piattaforma per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità hiPSC-CM, il potenziale di campo, il potenziale d’azione e il transitorio Ca2+. Questo protocollo fornisce una caratterizzazione completa della contrattilità e dell’elettrofisiologia hiPSC-CM. Questi saggi funzionali sono stati applicati in più pubblicazioni del nostro gruppo 12,13,18,24,25,26,27.<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Blake Wu per aver revisionato il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW) e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
