Tekniska tillämpningar av mikroelektrodmatris och patchkläminspelningar på humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter
Summary
Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en lovande in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta kontraktiliteten och elektrofysiologin hos hiPSC-CM.
Abstract
Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden. Att använda lämpliga prekliniska modeller för hjärtsäkerhetsbedömning är därför ett kritiskt steg under läkemedelsutvecklingen. För närvarande är hjärtsäkerhetsbedömningen fortfarande mycket beroende av djurstudier. Djurmodeller plågas dock av dålig translationell specificitet för människor på grund av artspecifika skillnader, särskilt när det gäller hjärtelektrofysiologiska egenskaper. Det finns därför ett akut behov av att utveckla en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning. Humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) har framstått som en ovärderlig in vitro-modell för läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och sjukdomsmodellering. hiPSC-CM kan erhållas från individer med olika genetisk bakgrund och olika sjuka tillstånd, vilket gör dem till ett idealiskt surrogat för att bedöma läkemedelsinducerad kardiotoxicitet individuellt. Därför måste metoder för att på ett heltäckande sätt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CM fastställas. I detta protokoll beskriver vi olika funktionella analyser som kan bedömas på hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalciumhantering. Sammantaget har införlivandet av hiPSC-CM i preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning potential att revolutionera läkemedelsutvecklingen.
Introduction
Läkemedelsutveckling är en lång och dyr process. En studie av nya terapeutiska läkemedel som godkänts av US Food and Drug Administration (FDA) mellan 2009 och 2018 rapporterade att den uppskattade mediankostnaden för kapitaliserad forskning och kliniska prövningar var 985 miljoner dollar per produkt1. Läkemedelsinducerad kardiotoxicitet är den främsta orsaken till läkemedelsförlust och tillbakadragande från marknaden2. I synnerhet rapporteras kardiotoxicitet bland flera klasser av terapeutiska läkemedel3. Därför är hjärtsäkerhetsbedömning en avgörande komponent under läkemedelsutvecklingsprocessen. Det nuvarande paradigmet för hjärtsäkerhetsbedömning är fortfarande starkt beroende av djurmodeller. Artskillnader från användningen av djurmodeller erkänns dock alltmer som en primär orsak till felaktiga förutsägelser för läkemedelsinducerad kardiotoxicitet hos mänskliga patienter4. Till exempel skiljer sig morfologin för hjärtåtgärdspotential väsentligt mellan människor och möss på grund av bidragen från olika repolariserande strömmar5. Dessutom har differentiella isoformer av hjärtmyosin och cirkulära RNA som kan påverka hjärtfysiologin dokumenterats väl bland arter 6,7. För att överbrygga dessa luckor är det absolut nödvändigt att upprätta en tillförlitlig, effektiv och människobaserad modell för preklinisk hjärtsäkerhetsbedömning.
Den banbrytande uppfinningen av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har genererat oöverträffade plattformar för läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering. Under det senaste decenniet har metoder för att generera humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade kardiomyocyter (hiPSC-CM) blivit väl etablerade 8,9. hiPSC-CMs har väckt stort intresse för deras potentiella tillämpningar inom sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Till exempel har hiPSC-CM använts för att modellera de patologiska fenotyperna av hjärtsjukdomar orsakade av genetiskt arv, såsom långt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 och dilaterad kardiomyopati13,14,15. Följaktligen har viktiga signalvägar som är inblandade i patogenesen av hjärtsjukdomar identifierats, vilket kan belysa potentiella terapeutiska strategier för effektiv behandling. Dessutom har hiPSC-CM använts för att screena läkemedelsinducerad kardiotoxicitet associerad med cancermedel, inklusive doxorubicin, trastuzumab och tyrosinkinashämmare16,17,18; Strategier för att mildra den resulterande kardiotoxiciteten undersöks. Slutligen möjliggör den genetiska informationen som lagras i hiPSC-CMs screening och förutsägelse av läkemedelsinducerad kardiotoxicitet på både individ- och populationsnivå19,20. Sammantaget har hiPSC-CM visat sig vara ett ovärderligt verktyg för personlig hjärtsäkerhetsförutsägelse.
Det övergripande målet med detta protokoll är att etablera metoder för att omfattande och effektivt undersöka de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, som är av stor betydelse för att tillämpa hiPSC-CMs mot sjukdomsmodellering, läkemedelsinducerad kardiotoxicitetsscreening och precisionsmedicin. Här beskriver vi en rad funktionella analyser för att bedöma de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CMs, inklusive mätning av kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och kalcium (Ca2+) hantering (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Mänsklig iPSC-teknik har vuxit fram som en kraftfull plattform för sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att mäta hiPSC-CM-kontraktilitet, fältpotential, åtgärdspotential och Ca2+ övergående. Detta protokoll ger en omfattande karakterisering av hiPSC-CM-kontraktilitet och elektrofysiologi. Dessa funktionella analyser har tillämpats i flera publikationer från vår grupp 12,13,18,24,25,26,27.</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Blake Wu för korrekturläsningen av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 och NASA NNX16A069A (JCW) och AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
- Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
- Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
- Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
- Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
- Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
- Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
- Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
- Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
- Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
- Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
- Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
- Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
- Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
- Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
- Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
- Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
- Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
- Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
- Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
- Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).
