न्यूरोनल प्रोग्रामिंग द्वारा उत्पन्न मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरॉन्स का प्रत्यारोपण न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक संभावित उपचार दृष्टिकोण हो सकता है। यह प्रोटोकॉल नवजात चूहों के दिमाग में मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक न्यूरोनल अग्रदूतों की पीढ़ी और प्रत्यारोपण का वर्णन करता है, जिससे ग्राफ्टेड न्यूरॉन्स की दीर्घकालिक जांच और उनकी चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन होता है।
निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन की कम संख्या या शिथिलता न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक आम योगदानकर्ता है। इसलिए, परिवर्तित न्यूरोनल सर्किट के प्रभावों को बदलने या कम करने के लिए इंटरन्यूरॉन का उपयोग करके सेल थेरेपी एक आकर्षक चिकित्सीय एवेन्यू है। इस अंत तक, इस बारे में अधिक ज्ञान की आवश्यकता है कि मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन जैसी कोशिकाएं (एचडीआईएन) मेजबान सर्किटरी में समय के साथ कैसे परिपक्व, एकीकृत और कार्य करती हैं। न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों में विशेष महत्व इस बात की बेहतर समझ है कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं में ये प्रक्रियाएं एक विकसित और परिपक्व मेजबान मस्तिष्क से प्रभावित होती हैं या नहीं। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों Ascl1 और Dlx2 की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के आधार पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से HDINs की एक तेज और अत्यधिक कुशल पीढ़ी का वर्णन करता है। इन न्यूरोनल अग्रदूतों को एकतरफा रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है, विट्रो में 7 दिनों के बाद, नवजात 2-दिन के चूहों के हिप्पोकैम्पस में। प्रत्यारोपित न्यूरॉन्स कॉर्टिकल डिस्प्लेसिया-फोकल एपिलेप्सी सिंड्रोम के माउस मॉडल के इप्सी- और विपरीत हिप्पोकैम्पस में फैलते हैं और प्रत्यारोपण के बाद 9 महीने तक जीवित रहते हैं। यह दृष्टिकोण स्वस्थ और रोगग्रस्त दिमाग विकसित करने में विस्तारित समय में प्रत्यारोपित इंटरन्यूरॉन की सेलुलर पहचान, एकीकरण, कार्यक्षमता और चिकित्सीय क्षमता की जांच करने की अनुमति देता है।
न्यूरोनल नेटवर्क की स्थापना, परिपक्वता और शोधन प्रसवकालीन और प्रारंभिक प्रसवोत्तर अवधि के दौरान होता है औरमस्तिष्क के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण समय विंडो को फिर से परिभाषित करता है। जन्म के बाद कनेक्टिविटी के उत्साह से, मस्तिष्क उन कनेक्शनों की एक अच्छी ट्यूनिंग के लिए विकसित होता है जो किशोरावस्था2 तक विस्तारित होते हैं। नतीजतन, इन अवधियों के दौरान व्यक्त जीन में परिवर्तन, साथ ही बाहरी कारक या अपमान, कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के लिए एक व्यक्ति की प्रवृत्ति को परिभाषित करते हैं। अनुभूति और मोटर फ़ंक्शन में हानि समय के साथ सामने आती है, और औषधीय उपचार सीमित होते हैं, अधिकांश गंभीर दुष्प्रभावों के जोखिम के साथ लक्षणों को लक्षित करते हैं।
गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) र्जिक निषेध में शिथिलता को विभिन्न न्यूरोडेवलपमेंटलविकारों 3, जैसे नाजुक एक्स सिंड्रोम, एंजेलमैन सिंड्रोम, मिर्गी, सिज़ोफ्रेनिया और ऑटिज़्म के अंतर्निहित कारण के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता दिखाया गया है। जीएबीए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का प्रमुख निरोधात्मक ट्रांसमीटर है और उत्तेजक / निरोधात्मक (ई / आई) संतुलन, न्यूरोनल फायरिंग के सिंक्रनाइज़ेशन और गणना को बनाए रखने के लिए सहायक है। जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन न्यूरॉन्स की एक विषम आबादी है, जिसमें अधिक जटिल मस्तिष्क क्षेत्रों में कार्यात्मक जटिलता बढ़ रही है4 और विकास 5,6 के साथ। मानव मस्तिष्क की सीमित अंतर्जात पुनर्योजी क्षमता और कई न्यूरोलॉजिकल विकारों में इंटरन्यूरॉन डिसफंक्शन के निहितार्थ को ध्यान में रखते हुए, जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन का प्रत्यारोपण पता लगाने के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय एवेन्यू हो सकता है। इस लाइन के साथ, मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन जैसी कोशिकाएं (एचडीआईएन) कृंतक एलोजेनिक न्यूरोनल अग्रदूतों या अन्य स्रोतों की तुलना में इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक ट्रांसलेशनल और व्यवहार्य स्रोत प्रतीत होतीहैं। विभिन्न सेल स्रोतों से जीएबीएर्जिक न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल 8,9,10,11,12,13 उपलब्ध हैं, लेकिन एक विकासशील पैथोलॉजिकल मस्तिष्क में समय के साथ एचडीआईएन कैसे परिपक्व, एकीकृत और कार्य करते हैं, इस पर अधिक ज्ञान की आवश्यकता है। कई अध्ययनों ने कॉर्टिकल पैटर्निंग के दौरान सक्रिय जीन में परिवर्तन की पहचान की है, न्यूरोनल कनेक्टिविटी14 स्थापित की है, और शारीरिक ई / आई संतुलन15 को ट्यून किया है। संबंधित आनुवंशिक गड़बड़ी के साथ माउस मॉडल में एचडीआईएन का नवजात प्रत्यारोपण हमें मेजबान और ग्राफ्ट के बीच परस्पर क्रिया का पालन करने की अनुमति देता है, जो संभावित चिकित्सीय रणनीतियों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक ज्ञान है।
इम्यूनोमॉड्यूलेशन का उपयोग आमतौर पर और सफलतापूर्वक जेनोग्राफ्ट प्रत्यारोपण में किया जाता है ताकि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अस्वीकृति 16 को ट्रिगर करने से बचाजा सके। हालांकि, इम्यूनोस्प्रेसिव दवाओं का प्रशासन, जैसे कि साइक्लोस्पोरिन ए, क्रोनिक प्रशासन के बाद गुर्दे की विषाक्तता का कारण बनता है, स्थिर प्रणालीगत सांद्रता प्राप्त करने के लिए दैनिक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन की आवश्यकता के कारण श्रम-गहन है, जिससे पशु तनाव17 होता है, और ऑफ-टारगेट प्रभाव होते हैं जो पैथोलॉजी18 के साथ बातचीत कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली से समझौता व्यवहार फेनोटाइप19 को बदलने के लिए दिखाया गया है, संबंधित न्यूरोएनाटोमिकल क्षेत्रोंमें परिवर्तन के साथ 20. जीवन के पहले सप्ताह में प्रत्यारोपण को प्रत्यारोपित कोशिकाओं21,22 के अनुकूलन की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है, जबकि अन्य ने प्रारंभिक जीवित रहने की सूचना दी है, जिसके बाद पहले प्रसवोत्तर महीने23,24 के भीतर ग्राफ्ट को अस्वीकार कर दिया गया है।
यह प्रोटोकॉल नवजात चूहों में एचडीआईएन पीढ़ी से सेल प्रत्यारोपण तक की प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जिसके परिणामस्वरूप दीर्घकालिक ग्राफ्ट अस्तित्व होता है और शारीरिक और रोग संबंधी विकास के दौरान प्रत्यारोपित मानव इंटरन्यूरॉन की न्यूरोनल विशिष्टता, सिनैप्टिक एकीकरण, कार्य और चिकित्सीय क्षमता की जांच की अनुमति मिलती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल विट्रो में एचडीआईएन अग्रदूतों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत, तेज, सरल और व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करता है और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के प्रीक्लिनिकल मॉडल में प्रारंभिक इंटरवेंशनल सेल थेरेपी के रूप में इसका उपयोग करता है।
भले ही किशोरावस्था या वयस्कता के दौरान न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के कुछ विशिष्ट फेनोटाइप उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्रारंभिक विकास के दौरान पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन पहले से ही मौजूद होते हैं। इस कारण से, रोगसूचकता या नैदानिक अभिव्यक्ति से पहले महत्वपूर्ण मस्तिष्क विकास अवधि में कार्य करके लाभकारी प्रभाव प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक हस्तक्षेप अत्यधिक आवश्यक होगा। भविष्य में, आनुवंशिक स्क्रीनिंग और बायोमाकर्स का विकास रोगनिरोधी या पूर्व-रोगसूचक उपचार को वहन करेगा, जो उन रोगियों के लिए एक गेम चेंजर का प्रतिनिधित्व करेगा। इसलिए, एचडीआईएन अग्रदूतों को Cntnap2 KO माउस मॉडल में जन्म के तुरंत बाद प्रत्यारोपित किया गया था जब न्यूरोनल नेटवर्क में एपिलेप्टोजेनिकपरिवर्तन चल रहे हो सकते हैं और एक समय बिंदु पर जिस पर इस पशु मॉडल29 में सेलुलर परिवर्तनों का वर्णन किया गया है। हालांकि, उम्र के सुधार के संभावित नुकसान और माउस बनाम मानव मस्तिष्क में कुछ प्रक्रियाओं के समय पर विचार करना महत्वपूर्ण है।
प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करते हुए, यहां प्रस्तुत भेदभाव प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारकों के उपयोग पर आधारित है, जो छोटे अणुओं10,30 के आधार पर कहीं और अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में स्टेम कोशिकाओं के तेज और अत्यधिक कुशल प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है। इस दृष्टिकोण का एक संभावित दोष लेंटिवायरल वैक्टर की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें सम्मिलन म्यूटेनेसिस का खतरा होता है। प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम क्रमशः टेराटोमा गठन के जोखिम से बचते हुए, प्रतिलेखन कारकों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के लिए चयन करने और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को खत्म करने के लिए माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं और एंटी-माइटोटिक एजेंट को जोड़ना है। यद्यपि इस अध्ययन में केवल एचडीआईएन अग्रदूतों का परीक्षण किया गया था, प्रक्रिया को अन्य सेल स्रोतों और प्रोग्रामिंग / भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ संभव होने की उम्मीद है। फिर भी, अन्य न्यूरोनल उपप्रकारों और / या मॉडल को मान्य किया जाना चाहिए।
प्रत्यारोपण के लिए एचडीआईएन अग्रदूत की आयु, 7 DIV, (i) प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं की अनुपस्थिति के आधार पर तय की गई थी, जिसका मूल्यांकन Ki67 के खिलाफ विकृति द्वारा किया गया था, (ii) पीओयू 5 एफ 1 जैसे प्लूरिपोटेंसी जीन की अभिव्यक्ति में कमी के पहले रिपोर्ट किए गए अवलोकन और उस समय न्यूरोनल मार्कर एमएपी 2 और इंटरन्यूरॉन मार्कर जीएडी 1 की उपस्थिति 8 के आधार पर तयकिया गया था। . हालांकि, इस प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाले मूल काम ने डीओएक्स निकासी9 के बाद 14 DIV पर प्रत्यारोपण किया। यह इस बारे में सवाल उठाता है कि क्या मां के पीने के पानी में डीओएक्स दूध के माध्यम से नर्सिंग पिल्ले के दिमाग में ग्राफ्ट की गई कोशिकाओं तक पहुंच सकता है, या यदि डीओएक्स प्रेरण का 7 DIV GABArgic भाग्य स्थापित करने के लिए पर्याप्त है। यद्यपि यांग एट अल ने विट्रो9 में स्थिर न्यूरोनल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए डीओएक्स के 14 दिनों की पहचान की, गोंजालेज-रामोस एट अल.8 ने पहले से ही 7 DIV पर जीएडी 1 जीन अभिव्यक्ति का पता लगाया, यह दर्शाता है कि Ascl1 और Dlx2 द्वारा GAD67 का डाउनस्ट्रीम सक्रियण पहले से ही इस समय हुआ है। इसलिए, पैटर्निंग 7 DIV पर शुरू हो गई है और DOX उपचार पर कम निर्भर हो सकती है। इसके अलावा, कृन्तकों और मनुष्यों में साक्ष्य स्तन के दूध31,32 में डीओएक्स की उपस्थिति को इंगित करते हैं, और यहां प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि ग्राफ्टेड एचडीआईएन 2 सप्ताह और 2 महीने पीटी पर एएससीएल 1 के लिए इम्यूनोरिएक्टिव थे और बाद में 9 महीने पीटी पर इंटरन्यूरॉन मार्कर थे। ग्राफ्टेड आबादी के भीतर, पीवी और एसएसटी पॉजिटिव न्यूरॉन्स के अलावा, इंटरन्यूरॉन की उप-आबादी के लिए अन्य मार्कर भी कम मात्रा में पाए गए, जैसे कि कैलरेटिनिन (सीआर) और कैलबिन्डिन (सीबी)।
इस प्रक्रिया का एक चुनौतीपूर्ण पहलू भेदभाव और पिल्ले की उम्र दोनों के लिए समय का समन्वय है। आमतौर पर, माउस गर्भधारण में संभोग पिंजरे को स्थापित करने के बाद 21 दिन लगते हैं, हालांकि यह कभी-कभी भिन्न हो सकता है। वयस्क कृन्तकों में सेल प्रत्यारोपण करते समय यह परिदृश्य नहीं होता है जब सब कुछ सावधानीपूर्वक नियोजित और व्यवस्थित किया जा सकता है। फिर भी, इसे 2 दिन के अंतराल के साथ दो से तीन संभोग पिंजरों या एक दूसरे से 2 दिन के समय-अंतराल के साथ दो से तीन भेदभाव बैचों को स्थापित करके आसानी से कम किया जा सकता है।
यद्यपि इस अध्ययन में उपयोग किए गए चूहे न तो इम्यूनोडेफिशिएंसी थे और न ही इम्यूनोसप्रेस्ड थे, प्रत्यारोपित कोशिकाएं विवो में 9 महीने तक जीवित रहीं, और ज़ेनोजेनिक कोशिकाओं या स्थानीय सूजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मार्कर पी 14 या 2 महीने पीटी पर नहीं देखे गए। 34. इसलिए, टी कोशिकाओं के मार्करों के साथ-साथ प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया के लिए विकृति का पता लगाया गया था। मेजबान ऊतक में ग्राफ्टेड कोशिकाओं की प्रतिरक्षा अस्वीकृति का कोई संकेत या तो प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया के स्तर से या पी 14 या 2 महीने में डब्ल्यूटी चूहों में टी लिम्फोसाइटों की उपस्थिति से नहीं पाया गया था। इसके अलावा, एस्ट्रोग्लियोसिस और भड़काऊ साइटोकिन्स के मूल्यांकन स्तर के आधार पर कोई स्थानीय सूजन नहीं देखी गई। यह परिणाम आंशिक रूप से नवजात प्रतिरक्षा सहिष्णुता 35,36,37 पर निर्भर हो सकता है, जो अन्य सेल पहचान, स्थानों और पशु मॉडल 35,38 द्वारा देखा गया है। एंग्लुंड एट अल ने प्रवासन और परिपक्वता के संदर्भ में ग्राफ्टेड कोशिकाओं के परिणाम में क्षेत्रीय अंतर की पहचान की, जिसमें आसन्न सफेद पदार्थ35 में ग्राफ्टेड कोशिकाओं का अवलोकन भी शामिल है।
अंत में, वयस्क कृन्तकों में प्रत्यारोपण करने वाले अन्य अध्ययनों की तुलना में हिप्पोकैम्पस के भीतर ग्राफ्टेड कोशिकाओं का अधिक फैलाव देखा गया, जहां एचडीआईएन एक ग्राफ्टेड कोर25 के रूप में बने रहे। यह फैलाव यांग एट अल.9 द्वारा पहले देखे गए परिणामों से भी भिन्न था, जिसे इस मामले में प्रत्यारोपण के समय कोशिकाओं की उम्र से समझाया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (अनुदान संख्या: 2016-02605, एमए), स्वीडिश ब्रेन फाउंडेशन एफ 02021-0369 (एमए), क्रैफूर्ड फाउंडेशन (एमए), और यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 कार्यक्रम (एच 2020-एमएससीए-आईटीएन -2016) द्वारा मैरी स्केडोव्स्का-क्यूरी इनोवेटिव ट्रेनिंग नेटवर्क प्रोजेक्ट ट्रेनिंग 4 सीआरएम नंबर 722779 के तहत वित्त पोषित किया गया था। हम पी 2 नवजात चूहों में स्टीरियोटैक्सिक सेल प्रत्यारोपण सिखाने के लिए जोसेप मारिया कैनाल्स लैब (स्टेम सेल और पुनर्योजी चिकित्सा प्रयोगशाला, बार्सिलोना विश्वविद्यालय) से एंड्रेस मिगुएज़ और ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में समूह के नेता मैकेंजी हॉवर्ड से मदद के लिए बेहद आभारी हैं। हम पशु देखभाल के साथ सहायता के लिए सुज़ैन गेरेस और ऊतक प्रसंस्करण के साथ मदद के लिए लिंग काओ को धन्यवाद देते हैं, साथ ही साथ उन छात्रों को जिन्होंने अध्ययन और विशेष रूप से डायना हैटामियन में एक या दूसरे तरीके से योगदान दिया है। अंत में, इस पेपर को चित्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ ग्राफिक्स BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |