合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

Summary

多くのアップレギュレーションされた遺伝子は、腫瘍細胞の遊走と浸潤を刺激し、予後不良につながります。どの遺伝子が腫瘍細胞の遊走と浸潤を制御しているかを決定することは非常に重要です。このプロトコルは腫瘍のセルの移動そして侵入に対する遺伝子の高められた表現の効果をリアルタイムで調査するための方法を示す。

Abstract

腫瘍細胞は運動性が高く侵襲性が高く、遺伝子発現パターンが変化します。遺伝子発現の変化が腫瘍細胞の遊走と浸潤をどのように制御するかについての知識は、腫瘍細胞が隣接する健康な組織に浸潤し、転移するメカニズムを理解するために不可欠です。これまで、遺伝子ノックダウンとそれに続くインピーダンスベースの腫瘍細胞の遊走と浸潤のリアルタイム測定により、腫瘍細胞の遊走と浸潤に必要な遺伝子を同定できることが実証されました。最近では、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの治療目的での合成mRNAの使用への関心が高まっています。ここでは、遺伝子の過剰発現が腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を研究するために、合成mRNAを用いた方法を改訂しました。この研究は、合成mRNAトランスフェクションとそれに続くインピーダンスベースのリアルタイム測定による遺伝子発現の上昇が、腫瘍細胞の移動と浸潤を刺激する遺伝子の同定に役立つ可能性があることを実証しています。この方法論文では、遺伝子発現の変化が腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を調べるための手順に関する重要な詳細を提供します。

Introduction

腫瘍細胞の運動性は転移に重要な役割を果たします^1,2。腫瘍細胞が近隣や遠隔地の健康な組織に広がると、がん治療が困難になり、再発の一因となります^3,4。したがって、腫瘍細胞の運動性のメカニズムを理解し、関連する治療戦略を開発することが不可欠です。多くの腫瘍細胞は遺伝子発現プロファイルを変化させているため、遺伝子発現プロファイルのどの変化が腫瘍細胞の運動性の変化につながるかを理解することは非常に重要です^5,6。

in vitroで細胞遊走を測定するために、いくつかのアッセイが開発されています。一部のアッセイでは、特定の時点でしか測定できないため、限られた情報しか提供されませんが、他のアッセイでは、腫瘍細胞の運動性に関する包括的な情報がリアルタイムで提供されます⁷。これらの細胞運動性アッセイの多くは、特定の時間またはエンドポイントで定量的な結果を得ることができますが、実験期間中の細胞遊走速度の動的変化に関する十分な詳細情報を提供することができません。また、細胞遊走速度の潜在的な変化は、実験計画、細胞の種類、細胞数によっては検討が困難な場合があります。さらに、単純な治療の効果は、従来の運動性アッセイの単純な定量化によって調査することができるが、様々な組み合わせ治療の複雑な効果を研究するには、より高度な定量化が必要になる^{かもしれない8。}

微小電極で覆われたマイクロタイタープレートウェル底の電流をモニターする装置が開発された⁹。ウェルの表面への細胞の接着は電子の流れを妨げ、インピーダンスは細胞の量的および定性的結合と相関します。坑井底に微小電極が存在することで、細胞の接着、拡散、増殖を測定できます。上部チャンバーの微多孔膜の下に微小電極が存在するため、下部チャンバーへの細胞移動と浸潤の測定が可能になり、上部チャンバーは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質でコーティングされ、侵入が可能になります¹⁰。

以前、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定は、実験全体を通してリアルタイムデータを提供し、さまざまな実験条件下で即座に比較および定量化できることが実証されました¹¹。その方法の論文では、腫瘍細胞の遊走と浸潤における目的のタンパク質の役割をテストするために、遺伝子ノックダウンが誘導されました。試験された実験条件下での本格的な遺伝子ノックダウン効果は、低分子干渉RNA(siRNA)によるエレクトロポレーション後3〜4日を要したため⁸、エレクトロポレーション後に細胞を再プレーティングし、3日後に再採取して、腫瘍細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースのリアルタイム測定を行いました。

キナーゼ(Crk)およびCrk様(CrkL)のCT10調節因子は、様々な成長因子受容体キナーゼ経路および非受容体チロシンキナーゼ経路の下流でタンパク質間相互作用を媒介するアダプタータンパク質である¹²。CrkおよびCrkLタンパク質のレベルの上昇は、神経膠芽腫を含むいくつかのヒト癌の予後不良に寄与する¹³。しかし、CrkおよびCrkLタンパク質の上昇がどのようにして予後不良につながるかは不明です。したがって、CrkおよびCrkLの過剰発現が腫瘍細胞機能に及ぼす影響を定義することが重要です。以前、遺伝子ノックダウン研究が実施され、膠芽腫細胞の遊走と浸潤には内因性のCrkおよびCrkLタンパク質が必要であることが実証されました⁸。ここでは、腫瘍細胞の遊走および浸潤に対するCrkおよびCrkLの過剰発現の影響に対処するために、修正されたアッセイシステムが開発されました。

近年、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンの開発により、mRNAのin vitro合成とその治療応用が改めて注目されています(Verbekeらによる^{レビュー14})。さらに、がんやその他の疾患における合成mRNAの使用において、目覚ましい進歩が見られました^15,16。細胞のエレクトロポレーションは、合成mRNAを送達し、一過性の遺伝子改変を誘導する効果的な方法であり(Campillo-Davoらによる^{レビュー17})、合成mRNAの使用により、不死化線維芽細胞における迅速かつ効率的な遺伝子発現が可能になります¹⁸。この方法論文では、合成mRNAを用いた遺伝子の過剰発現とリアルタイムの細胞解析を組み合わせて、腫瘍細胞の遊走と浸潤を研究しています。しかし、siRNAに用いられる実験スキームは、外因性タンパク質のレベルが合成mRNAトランスフェクションで急激に増加し、合成mRNAトランスフェクション時に徐々に減少するため、合成mRNAトランスフェクションでは機能しない¹⁸。そのため、トランスフェクション直後の細胞遊走や浸潤を、細胞を追加培養することなくリアルタイムに解析できるように改良しました。

この分析法論文は、インピーダンスベースのリアルタイム測定と、合成mRNAを用いた腫瘍細胞のトランスフェクションを組み合わせることで、遺伝子のアップレギュレーションが腫瘍細胞の遊走と浸潤に及ぼす影響を迅速かつ包括的に解析できることを実証しています。この方法の論文では、膠芽腫細胞の遊走と浸潤がCrkとCrkLの過剰発現によってどのように影響を受けるかを測定するための詳細な手順について説明します。この論文では、合成mRNAが腫瘍細胞の遊走に及ぼす影響を調べることで、タンパク質レベルの上昇が腫瘍細胞の遊走をどのように刺激するかを明確に説明しています。さらに、腫瘍細胞の浸潤に対する遺伝子発現の変化の影響を評価するために、ECMゲルの濃度を変化させるアプローチが提示されています。

Protocol

1. mRNAの合成 注:mRNA合成では、使用前にすべての試薬と機器を特別に処理してRNaseを不活性化する必要があります。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。 DNAの直鎖化注:CrkIおよびCrkLのマウスcDNAをpFLAG-CMV-5a発現ベクターにクローニングしてC末端にFLAGエピト…

Representative Results

CrkおよびCrkLタンパク質は、ニューロン22、T細胞23、線維芽細胞18,19、およびさまざまな腫瘍細胞13を含む多くの細胞タイプの運動性において重要な役割を果たします。膠芽腫ではCrkおよびCrkLタンパク質が上昇していることが報告されているため24,25,26<s…

Discussion

遊走と浸潤は腫瘍細胞の重要な特徴です。腫瘍細胞の運動性を測定し、腫瘍細胞の運動性を制御する根本的なメカニズムを理解することは、治療的介入に重要な洞察を提供します^2,27。細胞^遊走を研究するために、いくつかの方法が開発されている7。引っかき傷または培養インサートを使用した創傷治癒アッセイは、ギャップ閉鎖…

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).