Sanntids kvantitativ måling av tumorcellemigrasjon og invasjon etter syntetisk mRNA-transfeksjon

Summary

Mange oppregulerte gener stimulerer tumorcellemigrasjon og invasjon, noe som fører til dårlig prognose. Å bestemme hvilke gener som regulerer tumorcellemigrasjon og invasjon er kritisk. Denne protokollen presenterer en metode for å undersøke effekten av økt ekspresjon av et gen på migrasjon og invasjon av tumorceller i sanntid.

Abstract

Tumorceller er svært bevegelige og invasive og viser endrede genuttrykksmønstre. Kunnskap om hvordan endringer i genuttrykk regulerer tumorcellemigrasjon og invasjon er avgjørende for å forstå mekanismene for tumorcelleinfiltrasjon i nærliggende friskt vev og metastase. Tidligere ble det demonstrert at genknockdown etterfulgt av impedansbasert sanntidsmåling av tumorcellemigrasjon og invasjon muliggjør identifisering av gener som kreves for tumorcellemigrasjon og invasjon. Den siste tiden har mRNA-vaksinene mot SARS-CoV-2 økt interessen for å bruke syntetisk mRNA til terapeutiske formål. Her ble metoden ved hjelp av syntetisk mRNA revidert for å studere effekten av genoverekspresjon på tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne studien viser at forhøyet genuttrykk med syntetisk mRNA-transfeksjon etterfulgt av impedansbasert sanntidsmåling kan bidra til å identifisere gener som stimulerer tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne metodeartikkelen gir viktige detaljer om prosedyrene for å undersøke effekten av endret genuttrykk på tumorcellemigrasjon og invasjon.

Introduction

Tumorcellemotilitet spiller en avgjørende rolle i metastase ^1,2. Spredning av tumorceller til nærliggende og fjerntliggende friske vev gjør kreftbehandling vanskelig og bidrar til tilbakefall ^3,4. Derfor er det viktig å forstå mekanismene for tumorcellemotilitet og utvikle relevante terapeutiske strategier. Siden mange tumorceller har endrede genuttrykksprofiler, er det avgjørende å forstå hvilke endringer i genuttrykksprofilen som fører til endret tumorcellemotilitet ^5,6.

Flere analyser er utviklet for å måle cellemigrasjon in vitro. Noen analyser gir bare begrenset informasjon på grunn av bare å tillate målinger på bestemte tidspunkter, mens andre tilbyr omfattende informasjon om tumorcellemotilitet i sanntid⁷. Selv om mange av disse cellemotilitetsanalysene kan gi kvantitative resultater på et gitt tidspunkt eller endepunktet, klarer de ikke å gi tilstrekkelig detaljert informasjon om dynamiske endringer i hastigheten på cellemigrasjon over den eksperimentelle perioden. I tillegg kan det være vanskelig å undersøke potensielle endringer i cellemigrasjonshastigheten avhengig av eksperimentell design, celletyper og celletall. Videre kan effekten av ukompliserte behandlinger undersøkes ved enkel kvantifisering av tradisjonelle motilitetsanalyser, men mer sofistikert kvantifisering kan være nødvendig for å studere de komplekse effektene av ulike kombinerte behandlinger⁸.

Et instrument for å overvåke den elektriske strømmen til en mikrotiterplate som er godt dekket med mikroelektroder er utviklet⁹. Adhesjonen av celler til overflaten av brønnen hindrer elektronstrømmen, og impedansen korrelerer med den kvantitative og kvalitative bindingen av cellene. Tilstedeværelsen av mikroelektrodene på brønnbunnen muliggjør måling av celleadhesjon, spredning og spredning. Tilstedeværelsen av mikroelektrodene under en mikroporøs membran i det øvre kammeret muliggjør måling av cellemigrasjon og invasjon i det nedre kammeret, med det øvre kammeret belagt med ekstracellulære matriksproteiner (ECM) for å tillate invasjon¹⁰.

Tidligere ble det demonstrert at impedansbaserte sanntidsmålinger av tumorcellemigrasjon og invasjon gir sanntidsdata under hele eksperimentet, samt umiddelbare sammenligninger og kvantifiseringer under ulike eksperimentelle forhold¹¹. I den metodeoppgaven ble genknockdown indusert for å teste rollen til proteiner av interesse for tumorcellemigrasjon og invasjon. Siden en fullblåst gen-knockdown-effekt under de testede eksperimentelle forholdene tok 3-4 dager etter elektroporering med små forstyrrende RNA (siRNAer)⁸, ble cellene replisert etter elektroporeringen og høstet på nytt 3 dager senere for impedansbasert sanntidsmåling av tumorcellemigrasjon og invasjon.

CT10-regulator av kinase (Crk) og Crk-lignende (CrkL) er adaptorproteiner som medierer protein-protein-interaksjoner nedstrøms for ulike vekstfaktorreseptorkinaseveier og ikke-reseptortyrosinkinaseveier¹². Forhøyede nivåer av Crk- og CrkL-proteiner bidrar til dårlig prognose i flere humane kreftformer, inkludert glioblastom¹³. Det er imidlertid uklart hvordan forhøyede Crk- og CrkL-proteiner fører til dårlig prognose. Derfor er det viktig å definere effekten av Crk og CrkL overekspresjon på tumorcellefunksjoner. Tidligere ble det utført en gen-knockdown-studie for å demonstrere at endogene nivåer av Crk- og CrkL-proteiner er nødvendige for glioblastomcellemigrasjon og invasjon⁸. Her er det utviklet et modifisert analysesystem for å adressere effekten av Crk og CrkL-overekspresjon på tumorcellemigrasjon og invasjon.

Nylig har in vitro-syntesen av mRNA og dens terapeutiske anvendelser fått fornyet oppmerksomhet på grunn av utviklingen av mRNA-vaksinene mot SARS-CoV-2 (gjennomgått av Verbeke et ^al.14). I tillegg er det gjort bemerkelsesverdige fremskritt ved bruk av syntetisk mRNA i kreft og andre sykdommer^15,16. Elektroporering av celler er en effektiv metode for å levere syntetisk mRNA og indusere forbigående genetisk modifikasjon (gjennomgått av Campillo-Davo et al.17), og bruk av syntetisk mRNA muliggjør rask og effektiv genekspresjon i udødeliggjorte fibroblaster ¹⁸. Denne metodeartikkelen kombinerer genoverekspresjon ved hjelp av syntetisk mRNA med sanntids celleanalyser for å studere tumorcellemigrasjon og invasjon. Imidlertid virker det eksperimentelle skjemaet som brukes til siRNA ikke med syntetisk mRNA-transfeksjon, da nivået av eksogene proteiner øker raskt og reduseres gradvis ved syntetisk mRNA-transfeksjon¹⁸. Derfor har metoden blitt modifisert for å utføre sanntidsanalyse av cellemigrasjon og invasjon rett etter transfeksjonen uten å dyrke cellene i tillegg.

Denne metodeartikkelen demonstrerer at kombinasjon av impedansbaserte sanntidsmålinger med transfeksjon av tumorceller med syntetiske mRNA gir en rask og omfattende analyse av effekten av genoppregulering på tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne metodeartikkelen beskriver detaljerte prosedyrer for å måle hvordan migrasjon og invasjon av glioblastomceller påvirkes av overekspresjon av Crk og CrkL. Ved å undersøke de konsentrasjonsavhengige effektene av syntetisk mRNA på tumorcellemigrasjon, beskriver papiret tydelig hvordan en økning i proteinnivåer stimulerer tumorcellemigrasjon. I tillegg presenteres en tilnærming med varierende konsentrasjon av ECM-gelen for å vurdere effekten av endringer i genuttrykk på tumorcelleinvasjon.

Protocol

1. Syntese av mRNA MERK: For mRNA-syntesen må alle reagensene og utstyret behandles spesielt for å inaktivere RNasene før bruk. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i denne protokollen. Linearisering av DNAMERK: Mus-cDNA fra CrkI og CrkL ble klonet inn i pFLAG-CMV-5a-ekspresjonsvektoren for å legge til FLAG-epitopkoden ved C-terminalen og subklonet inn i pcDNA3.1/myc-H…

Representative Results

Crk og CrkL proteiner spiller viktige roller i motiliteten til mange celletyper, inkludert nevroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 og en rekke tumorceller13. Siden Crk- og CrkL-proteiner har blitt rapportert å være forhøyet i glioblastom24,25,26, ble effekten av overekspresjon av CrkI, en spleisevariant av Crk,…

Discussion

Migrasjon og invasjon er viktige trekk ved tumorceller. Måling av motiliteten til tumorceller og forståelse av den underliggende mekanismen som styrer tumorcellemotilitet gir kritisk innsikt i terapeutiske inngrep ^2,27. Det er utviklet flere metoder for å studere cellemigrasjon⁷. Sårhelingsanalysen ved hjelp av riper eller kulturinnlegg er en enkel og ofte brukt metode som gir kontrasterende bilder av hulllukking. Den individuelle cell…

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).