Medición cuantitativa en tiempo real de la migración e invasión de células tumorales después de la transfección de ARNm sintético

Summary

Muchos genes regulados al alza estimulan la migración y la invasión de las células tumorales, lo que lleva a un mal pronóstico. Es fundamental determinar qué genes regulan la migración y la invasión de las células tumorales. Este protocolo presenta un método para investigar los efectos del aumento de la expresión de un gen en la migración e invasión de células tumorales en tiempo real.

Abstract

Las células tumorales son altamente móviles e invasivas y muestran patrones de expresión génica alterados. El conocimiento de cómo los cambios en la expresión génica regulan la migración e invasión de células tumorales es esencial para comprender los mecanismos de infiltración de células tumorales en los tejidos sanos vecinos y la metástasis. Anteriormente, se demostró que la eliminación de genes seguida de la medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células tumorales permite la identificación de los genes necesarios para la migración e invasión de células tumorales. Recientemente, las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 han aumentado el interés en el uso de ARNm sintético con fines terapéuticos. Aquí, se revisó el método que utiliza ARNm sintético para estudiar el efecto de la sobreexpresión génica en la migración e invasión de células tumorales. Este estudio demuestra que la expresión génica elevada con transfección sintética de ARNm seguida de una medición en tiempo real basada en impedancia puede ayudar a identificar los genes que estimulan la migración e invasión de células tumorales. Este artículo sobre el método proporciona detalles importantes sobre los procedimientos para examinar el efecto de la expresión génica alterada en la migración e invasión de células tumorales.

Introduction

La motilidad de las células tumorales juega un papel crucial en la metástasis ^1,2. La diseminación de las células tumorales a los tejidos sanos vecinos y remotos dificulta el tratamiento del cáncer y contribuye a la recurrencia ^3,4. Por lo tanto, es esencial comprender los mecanismos de motilidad de las células tumorales y desarrollar estrategias terapéuticas relevantes. Dado que muchas células tumorales tienen perfiles de expresión génica alterados, es crucial comprender qué cambios en el perfil de expresión génica conducen a una motilidad alterada de las células tumorales ^5,6.

Se han desarrollado varios ensayos para medir la migración celular in vitro. Algunos ensayos solo proporcionan información limitada debido a que solo permiten mediciones en puntos de tiempo específicos, mientras que otros ofrecen información completa sobre la motilidad de las células tumorales en tiempo real⁷. Aunque muchos de estos ensayos de motilidad celular pueden proporcionar resultados cuantitativos en un momento dado o en el punto final, no proporcionan información suficientemente detallada sobre los cambios dinámicos en la tasa de migración celular durante el período experimental. Además, puede ser difícil examinar los posibles cambios en la tasa de migración celular dependiendo del diseño experimental, los tipos de células y el número de células. Además, los efectos de los tratamientos sin complicaciones pueden investigarse mediante la cuantificación simple de los ensayos de motilidad tradicionales, pero puede ser necesaria una cuantificación más sofisticada para estudiar los efectos complejos de varios tratamientos combinados⁸.

Se ha desarrollado un instrumento para monitorizar la corriente eléctrica de un pozo de placa de microtitulación cubierto con microelectrodos⁹. La adhesión de las células a la superficie del pozo impide el flujo de electrones, y la impedancia se correlaciona con la unión cuantitativa y cualitativa de las células. La presencia de los microelectrodos en el fondo del pozo permite medir la adhesión, propagación y proliferación celular. La presencia de los microelectrodos debajo de una membrana microporosa de la cámara superior permite medir la migración celular y la invasión hacia la cámara inferior, con la cámara superior recubierta con proteínas de la matriz extracelular (MEC) para permitir la invasión¹⁰.

Anteriormente, se demostró que las mediciones en tiempo real basadas en impedancia de la migración e invasión de células tumorales proporcionan datos en tiempo real durante todo el experimento, así como comparaciones y cuantificaciones instantáneas en diversas condiciones experimentales¹¹. En ese artículo de método, se indujo la eliminación de genes para probar el papel de las proteínas de interés en la migración e invasión de células tumorales. Dado que un efecto de eliminación de genes en toda regla en las condiciones experimentales probadas tardó 3-4 días después de la electroporación con pequeños ARN interferentes (siRNAs)⁸, las células se recolocaron después de la electroporación y se volvieron a cosechar 3 días después para la medición en tiempo real basada en la impedancia de la migración e invasión de las células tumorales.

CT10 regulador de la quinasa (Crk) y similar a la Crk (CrkL) son proteínas adaptadoras que median las interacciones proteína-proteína aguas abajo de varias vías de la quinasa receptora del factor de crecimiento y las vías de la tirosina quinasa no receptora¹². Los niveles elevados de las proteínas Crk y CrkL contribuyen a un mal pronóstico en varios cánceres humanos, incluido el glioblastoma¹³. Sin embargo, no está claro cómo las proteínas Crk y CrkL elevadas conducen a un mal pronóstico. Por lo tanto, es importante definir el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL sobre las funciones de las células tumorales. Anteriormente, se realizó un estudio de knockdown génico para demostrar que los niveles endógenos de las proteínas Crk y CrkL son necesarios para la migración e invasión de células de glioblastoma⁸. Aquí, se ha desarrollado un sistema de ensayo modificado para abordar el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL en la migración e invasión de células tumorales.

Recientemente, la síntesis in vitro de ARNm y sus aplicaciones terapéuticas han vuelto a llamar la atención debido al desarrollo de las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et ^al.14). Además, se han logrado avances notables en el uso de ARNm sintético en cáncer y otras enfermedades^15,16. La electroporación de células es un método eficaz para administrar ARNm sintético e inducir modificaciones genéticas transitorias (revisado por Campillo-Davo et ^al.17), y el uso de ARNm sintético permite una expresión génica rápida y eficiente en fibroblastos inmortalizados¹⁸. Este artículo de método combina la sobreexpresión génica utilizando ARNm sintético con análisis celulares en tiempo real para estudiar la migración e invasión de células tumorales. Sin embargo, el esquema experimental utilizado para los siRNAs no funciona con la transfección de ARNm sintético, ya que el nivel de proteínas exógenas aumenta rápidamente y disminuye gradualmente tras la transfección de ARNm sintético¹⁸. Por lo tanto, el método se ha modificado para llevar a cabo el análisis en tiempo real de la migración e invasión celular justo después de la transfección sin cultivar adicionalmente las células.

Este artículo de método demuestra que la combinación de mediciones en tiempo real basadas en impedancia con la transfección de células tumorales con ARNm sintéticos proporciona un análisis rápido y completo de los efectos de la regulación positiva de genes en la migración e invasión de células tumorales. Este artículo describe procedimientos detallados para medir cómo la migración y la invasión de las células de glioblastoma se ven afectadas por la sobreexpresión de Crk y CrkL. Al examinar los efectos dependientes de la concentración del ARNm sintético en la migración de células tumorales, el artículo describe claramente cómo un aumento en los niveles de proteínas estimula la migración de células tumorales. Además, se presenta un enfoque de variación de la concentración del gel de MEC para evaluar los efectos de los cambios en la expresión génica sobre la invasión de células tumorales.

Protocol

1. Síntesis de ARNm NOTA: Para la síntesis de ARNm, todos los reactivos y equipos deben ser tratados especialmente para inactivar las ARNasas antes de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo. Linealización del ADNNOTA: Los ADNc de ratón de CrkI y CrkL se clonaron en el vector de expresión pFLAG-CMV-5a para añadir la etiq…

Representative Results

Las proteínas Crk y CrkL desempeñan un papel importante en la motilidad de muchos tipos de células, incluidas las neuronas22, las células T23, los fibroblastos 18,19 y una variedad de células tumorales13. Dado que se ha descrito que las proteínas Crk y CrkL están elevadas en el glioblastoma24,25,26, en este trabajo se estudiaron los efectos de la sobreexpresión…

Discussion

La migración y la invasión son características importantes de las células tumorales. La medición de la motilidad de las células tumorales y la comprensión del mecanismo subyacente que controla la motilidad de las células tumorales proporcionan información crítica sobre las intervenciones terapéuticas ^2,27. Se han desarrollado varios métodos para estudiar la migración celular⁷. El ensayo de cicatrización de heridas mediante ar…

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).