Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum

Summary

Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche dans la méduse Cladonema. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier avec un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules souches, et le marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine permet l’identification des cellules proliférantes. Ensemble, des cellules souches proliférant activement peuvent être détectées.

Abstract

Les cnidaires, y compris les anémones de mer, les coraux et les méduses, présentent une morphologie et des modes de vie variés qui se manifestent par des polypes sessiles et des méduses nageant librement. Comme l’illustrent les modèles établis tels que Hydra et Nematostella, les cellules souches et/ou les cellules prolifératives contribuent au développement et à la régénération des polypes cnidaires. Cependant, les mécanismes cellulaires sous-jacents chez la plupart des méduses, en particulier au stade de la méduse, sont largement flous et, par conséquent, le développement d’une méthode robuste pour identifier des types cellulaires spécifiques est essentiel. Cet article décrit un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche chez la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum. Cladonema medusae possède des tentacules ramifiés qui se développent continuellement et maintiennent une capacité de régénération tout au long de leur stade adulte, fournissant une plate-forme unique pour étudier les mécanismes cellulaires orchestrés par la prolifération et / ou les cellules souches. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier (FISH) à l’aide d’un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules de type souches, tandis que le marquage par impulsions avec la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), un marqueur de phase S, permet l’identification des cellules proliférantes. En combinant à la fois l’étiquetage FISH et EdU, nous pouvons détecter la prolifération active de cellules souches sur des animaux fixes, et cette technique peut être largement appliquée à d’autres animaux, y compris des espèces de méduses non modèles.

Introduction

Cnidaria est considéré comme un phylum métazoaire à ramification basale contenant des animaux dotés de nerfs et de muscles, les plaçant dans une position unique pour comprendre l’évolution du développement et de la physiologie des animaux ^1,2. Les cnidaires sont classés en deux groupes principaux: les anthozoaires (par exemple, les anémones de mer et les coraux) ne possèdent que des larves de planula et des stades de polypes sessiles, tandis que les méduses (membres des hydrozoaires, des staurozoaires, des scyphozoaires et des cubozoa) prennent généralement la forme de méduses nageant librement, ou méduses, ai....

Protocol

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Synthèse de sonde

1. Extraction d’ARN
   1. Placez trois Cladonema medusae vivants cultivés dans de l’eau de mer artificielle (ASW) dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert de 3,1 mL avec l’embout coupé, et retirez autant d’ASW que possible.
      NOTE: ASW est préparé en dissolvant un mélange de sels minéraux dans l’eau du robinet avec un neutralisant de chlore; la densité finale (S.G.) est de 1,018 ou les parties pour mille (ppt) ....

Results

Les tentacules du cladonème ont été utilisés comme modèle pour étudier les processus cellulaires de morphogenèse et de régénération^15,16,17. La structure du tentacule est composée d’un tube épithélial où des cellules de type souche, ou cellules i, sont situées dans la région proximale, appelée bulbe tentacule, et de nouvelles branches sont ajoutées séquentiellement à l’arrière de la région distale du bulbe le long du cô.......

Discussion

Les cellules proliférantes et les cellules souches sont des sources cellulaires importantes dans divers processus tels que la morphogenèse, la croissance et la régénération^21,22. Cet article décrit une méthode de co-coloration du marqueur de cellules souches Nanos1 par marquage FISH et EdU chez Cladonema medusae. Des travaux antérieurs utilisant le marquage EdU ou BrdU ont suggéré que les cellules prolifératives se localisent aux bulbes tentacul.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol  ;	Wako	137-06862
Pipette de transfert 3,1 mL	Thermo Scientific	233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside (X-Gal)	Wako	029-15043
anti-DIG-POD	Roche	11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 amorce			5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'
Cladonema pacificum Nanos1 amorce			5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3'
Cladonema pacificum Piwi amorce			5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'
Cladonema pacificum Piwi amorce			5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'
Kit de prolifération cellulaire Click-iT EdU pour l’imagerie, colorant Alexa Fluor 488	Invitrogen  ;	C10337	Kit EdU
Coroline off	GEX Co. ltd	N/A	Neutralisateur de chlore
DIG Kit de détection d’acide nucléique Réactif de blocage	Roche	11175041910	tampon de blocage  ;
Mélange de marquage de l’ARN DIG³	Roche	11277073910
DTT  ;	Promega	P117B
ECOS cellule compétente DH5&alpha ;	NIPPON GENE	316-06233	cellule compétente
Kit d’extraction rapide de gènes Gel/PCR Kit d’extraction	de gènes rapides	FG-91302	Kit d’extraction de gel
de gènes rapides Mini kit de plasmide	de gènes rapides Gène	rapide FG-90502	miniprep
Formamide	Wako  ;	068-00426
Sel d’héparine sodique de porc	SIGMA-ALDRICH  ;	H3393-10KU
Isopropyl-&beta ;-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)	Wako	096-05143
LB Agar	Invitrogen	22700-025	plaque
gélose LB Base de bouillon	Invitrogen	12780-052	LB medium
Acide maléique	Wako	134-00495
mini Colonnes d’ARN à spin rapide	Roche	11814427001	colonne de nettoyage
NaCl	Wako  ;	191-01665
NanoDrop OneC Spectrophotomètre UV-Vis microvolume avec Wi-Fi	Thermo Scientific	Spectrophotomètre	ND-ONEC-W
Polyoxyéthylène (20) Monolaurate de sorbitan (Tween-20)	Wako  ;	166-21115
Presse-Batteur 2	nippi  ;	891300	homogénéisateur
Protéinase K	Nacarai Tesque  ;	29442-14
Inhibiteur de RNase	TaKaRa	2313A
RNeasy Mini kit	Qiagen  ;	74004	kit d’isolement de l’ARN total
RQ1 RNase sans RNase	Promega	M6101
Tampon salin de citrate de sodium 20x poudre (20x SSC)	TaKaRa	T9172
SEA LIFE	Marin Tech	N/A	mélange de sels minéraux
T3 ARN polymérase  ;	ARN
T7	Roche	10881767001
TAITEC HB-100	TAITEC	0040534-000	Incubateur d’hybridation
TaKaRa Ex Taq  ;	TaKaRa	RR001A	Taq DNA polymérase
TaKaRa PrimeScript 2 1st brin Kit	synthèse d’ADNc	TaKaRa	6210A
Clone	TOYOBO  ;	TAK101	pTA2 Vector
ARNt	Roche	10109541001
TSA Plus Cyanine 5	AKOYA Biosciences	NEL745001KT	technique d’amplification du signal tyramide (TSA)
Zeiss LSM 880	ZEISS	N/A	microscope confocal à balayage laser