Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L’ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2′-deossiuridina consente l’identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.
Abstract
Gli cnidiari, tra cui anemoni di mare, coralli e meduse, mostrano morfologie e stili di vita diversi che si manifestano in polipi sessili e meduse che nuotano liberamente. Come esemplificato in modelli consolidati come Hydra e Nematostella, le cellule staminali e/o le cellule proliferative contribuiscono allo sviluppo e alla rigenerazione dei polipi cnidariani. Tuttavia, i meccanismi cellulari sottostanti nella maggior parte delle meduse, in particolare allo stadio di medusa, sono in gran parte poco chiari e, quindi, lo sviluppo di un metodo robusto per identificare specifici tipi di cellule è fondamentale. Questo articolo descrive un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum. Cladonema medusae possiede tentacoli ramificati che crescono continuamente e mantengono la capacità rigenerativa durante la loro fase adulta, fornendo una piattaforma unica con cui studiare i meccanismi cellulari orchestrati da cellule proliferanti e / o staminali. L’ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero (FISH) che utilizza un marcatore di cellule staminali consente la rilevazione di cellule staminali, mentre la marcatura a impulsi con 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU), un marcatore di fase S, consente l’identificazione delle cellule proliferanti. Combinando sia l’etichettatura FISH che EdU, possiamo rilevare cellule staminali che proliferano attivamente su animali fissi e questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri animali, comprese le specie di meduse non modello.
Introduction
Cnidaria è considerato un phylum metazoico basalmente ramificato contenente animali con nervi e muscoli, ponendoli in una posizione unica per comprendere l’evoluzione dello sviluppo animale e della fisiologia 1,2. Gli Cnidari sono classificati in due gruppi principali: gli antozoi (ad esempio, anemoni di mare e coralli) possiedono solo larve di planula e stadi di polipo sessili, mentre i Medusozoi (membri di Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa e Cubozoa) assumono tipicamente la forma di meduse che nuotano liberamente, o meduse, così come larve di planula e polipi. Gli Cnidari mostrano comunemente un’elevata capacità rigenerativa e i loro meccanismi cellulari sottostanti, in particolare il possesso di cellule staminali adulte e cellule proliferative, hanno attirato molta attenzione 3,4. Inizialmente identificate in Hydra, le cellule staminali idrozoiche si trovano negli spazi interstiziali tra le cellule epiteliali ectodermiche e sono comunemente indicate come cellule interstiziali o cellulei-3.
Le cellule i-idrozoiche condividono caratteristiche comuni che includono la multipotenza, l’espressione di marcatori di cellule staminali ampiamente conservati (ad esempio, Nanos, Piwi, Vasa) e il potenziale di migrazione 3,5,6,7,8. Come cellule staminali funzionali, le cellule i-sono ampiamente coinvolte nello sviluppo, nella fisiologia e nelle risposte ambientali degli animali idrozoi, il che attesta la loro elevata capacità rigenerativa e plasticità3. Mentre le cellule staminali, simili alle cellule i, non sono state identificate al di fuori degli idrozoi, anche nella specie modello stabilita Nematostella, le cellule proliferative sono ancora coinvolte nel mantenimento e nella rigenerazione del tessuto somatico, così come la linea germinale9. Poiché gli studi sullo sviluppo e la rigenerazione cnidariana sono stati condotti prevalentemente su animali di tipo polipo come Hydra, Hydractinia e Nematostella, la dinamica cellulare e le funzioni delle cellule staminali nelle specie di meduse rimangono in gran parte non affrontate.
La medusa idrozoica Clytia hemisphaerica , una specie di medusa cosmopolita con diversi habitat in tutto il mondo, tra cui il Mar Mediterraneo e il Nord America, è stata utilizzata come animale modello sperimentale in diversi studi evolutivi e sullo sviluppo10. Con le sue piccole dimensioni, la facilità d’uso e le uova di grandi dimensioni, Clytia è adatto per la manutenzione in laboratorio, nonché per l’introduzione di strumenti genetici come i metodi di transgenesi e knockout recentemente stabiliti11, aprendo l’opportunità di un’analisi dettagliata dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della biologia delle meduse. Nel tentacolo di Clytia medusa, le cellule I sono localizzate nella regione prossimale, chiamata bulbo, e i progenitori come i nematoblasti migrano verso la punta distale differenziandosi in tipi cellulari distinti, compresi i nematociti12.
Durante la rigenerazione del Clytia manubrium, l’organo orale delle meduse, le cellule Nanos1+ i-che sono presenti nelle gonadi migrano nella regione in cui il manubrio viene perso in risposta al danno e partecipano alla rigenerazione del manubrio7. Questi risultati supportano l’idea che le cellule i-in Clytia si comportano anche come cellule staminali funzionali coinvolte nella morfogenesi e nella rigenerazione. Tuttavia, dato che le proprietà delle cellule i-differiscono tra animali rappresentativi di tipo polipo come Hydra e Hydractinia3, è possibile che le caratteristiche e le funzioni delle cellule staminali siano diversificate tra le specie di meduse. Inoltre, con l’eccezione di Clytia, le tecniche sperimentali sono state limitate per altre meduse, e la dinamica dettagliata delle cellule proliferative e delle cellule staminali è sconosciuta13.
La medusa idrozoica Cladonema pacificum è un organismo modello emergente che può essere conservato in un ambiente di laboratorio senza pompa dell’acqua o sistema di filtrazione. Il Cladonema medusa ha tentacoli ramificati, una caratteristica comune nella famiglia Cladonematidae, e un organo fotorecettore chiamato ocello sullo strato ectodermico vicino al bulbo14. Il processo di ramificazione dei tentacoli si verifica in un nuovo sito di ramificazione che appare lungo il lato adassiale del tentacolo. Nel corso del tempo, i tentacoli continuano ad allungarsi e ramificarsi, con i rami più vecchi spinti verso la punta15. Inoltre, i tentacoli Cladonema possono rigenerarsi entro pochi giorni dall’amputazione. Studi recenti hanno suggerito il ruolo delle cellule proliferanti e delle cellule staminali nella ramificazione e rigenerazione dei tentacoli in Cladonema16,17. Tuttavia, mentre l’ibridazione convenzionale in situ (ISH) è stata utilizzata per visualizzare l’espressione genica in Cladonema, a causa della sua bassa risoluzione, è attualmente difficile osservare de dettaglio la dinamica delle cellule staminali a livello cellulare.
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare cellule staminali simili a Cladonema mediante FISH e co-colorazione con EdU, un marker di proliferazione cellulare18. Visualizziamo il pattern di espressione di Nanos1, un marcatore di cellule staminali 5,17, di FISH, che consente l’identificazione della distribuzione delle cellule staminali a livello di singola cellula. Inoltre, la co-colorazione dell’espressione di Nanos1 con l’etichettatura EdU consente di distinguere le cellule staminali che proliferano attivamente. Questo metodo per monitorare sia le cellule staminali che le cellule proliferative può essere applicato a una vasta gamma di aree di indagine, tra cui la ramificazione dei tentacoli, l’omeostasi dei tessuti e la rigenerazione degli organi in Cladonema, e un approccio simile può essere applicato ad altre specie di meduse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule proliferanti e le cellule staminali sono importanti fonti cellulari in vari processi come la morfogenesi, la crescita e la rigenerazione21,22. Questo articolo descrive un metodo per co-colorare il marcatore di cellule staminali Nanos1 mediante marcatura FISH e EdU in Cladonema medusae. Lavori precedenti che utilizzano l’etichettatura EdU o BrdU hanno suggerito che le cellule proliferative si localizzano nei bulbi tentacolari<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da AMED con il numero di sovvenzione JP22gm6110025 (a Y.N.) e dal JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (a Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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