使用肽-泊洛沙明纳米颗粒在培养细胞中高效转染 体外 转录的mRNA
Summary
使用微流体混合装置开发自组装肽 – 泊洛沙明纳米颗粒（PP-sNp）以封装和递送 体外 转录的信使RNA。所描述的mRNA / PP-sNp可以在 体外有效地转染培养的细胞。
Abstract
体外 转录的信使RNA（mRNA）疫苗在抗击2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行方面显示出巨大的潜力。由于mRNA的易碎特性，mRNA疫苗中必须包含高效和安全的递送系统。自组装的肽-泊洛沙明纳米颗粒（PP-sNp）基因递送系统专为核酸的肺递送而设计，在介导成功的mRNA转染方面显示出有希望的能力。这里描述了一种制备PP-sNp的改进方法，以详细说明PP-sNp如何包封荧光素酶（MetLuc）mRNA并成功转染培养的细胞。甲基强质-mRNA是通过从线性DNA模板 的体外 转录过程获得的。通过使用微流体混合器将合成肽/泊洛沙明与mRNA溶液混合来产生PP-sNp，从而允许PP-sNp的自组装。随后通过测量zeta电位来评估PP-sNp的电荷。同时，采用动态光散射法测量了PP-sNp纳米粒子的多分散度和流体动力学尺寸.将mRNA / PP-sNp纳米颗粒转染到培养的细胞中，并测定细胞培养物中的上清液的荧光素酶活性。代表性结果证明了其 体外 转染能力。该协议可能有助于开发下一代mRNA疫苗递送系统。
Introduction
疫苗接种被誉为降低传染病发病率和死亡率的最有效医疗干预措施之一1.自2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发以来，疫苗的重要性已经得到证明。与注射灭活或减毒活病原体的传统概念相反，最先进的疫苗方法，如基于核酸的疫苗，侧重于保持目标病原体的免疫刺激特性，同时避免与传统的全微生物病毒或基于细菌的疫苗相关的潜在安全问题。基于DNA和RNA（即 体外 转录的信使RNA，IVT mRNA）的疫苗都表现出对多种疾病的预防治疗潜力，包括传染病和癌症2，3。原则上，基于核酸的疫苗的潜力与其生产、功效和安全性有关4.这些疫苗可以以无细胞的方式生产，以实现具有成本效益，可扩展和快速的生产。
基于单一核酸的疫苗可以编码多种抗原，从而能够以较少的接种次数靶向多种病毒变异或细菌，并增强对弹性病原体的免疫反应5，6。此外，基于核酸的疫苗可以模仿病毒或细菌感染的自然侵袭过程，带来B细胞和T细胞介导的免疫反应。与一些基于病毒或基于DNA的疫苗不同，基于IVT mRNA的疫苗在安全性方面具有巨大的优势。它们可以在细胞质基质中快速表达所需的抗原，并且不会整合到宿主基因组中，从而消除了对插入诱变7的担忧。IVT-mRNA在成功翻译后自动降解，因此其蛋白表达动力学可以很容易地控制在8，9。在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的催化下，全球公司/机构的努力使许多类型的疫苗能够投放市场。基于IVT mRNA的疫苗技术显示出巨大的潜力，并且由于其快速设计和灵活的能力，可以在几个月内适应任何靶抗原，因此首次显示出其先前预期的成功。IVT mRNA疫苗抗击COVID-19的成功应用，不仅开启了IVT mRNA疫苗研发的新时代，也为快速开发应对传染病暴发的有效疫苗积累了宝贵经验10，11.
尽管IVT mRNA疫苗具有广阔的潜力，但IVT mRNA在细胞内有效递送到作用部位（即细胞质）仍然是一个主要障碍12，特别是对于 通过 气道4施用的疫苗。IVT mRNA本质上是一种不稳定的分子，具有极短的半衰期（~7小时）13，这使得IVT mRNA极易被无处不在的RNase14降解。在 体内 应用的情况下，先天免疫系统的淋巴细胞倾向于吞噬公认的IVT mRNA。此外，IVT mRNA的高负电荷密度和大分子量（1 x 104-10 10 6 Da）损害了其在细胞膜阴离子脂质双层中的有效渗透15。因此，需要具有某些生物官能材料的递送系统来抑制IVT mRNA分子的降解并促进细胞摄取16。
除了一些直接用于体内研究的裸IVT mRNA的特殊情况 外 ，还使用各种递送系统将IVT mRNA携带到作用17，18的治疗位点。先前的研究表明，在没有递送系统19的帮助下，在细胞质基质中仅检测到少数IVT mRNA。通过在该领域的不断努力，已经开发了许多策略来改善RNA递送，从鱼精蛋白缩合到脂质包封20。脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA递送载体中临床上最先进的，所有经批准的临床用途mRNA COVID-19疫苗都采用基于LNP的递送系统21这一事实证明了这一点。然而，当制剂 通过 呼吸途径22递送时，LNPs不能介导有效的mRNA转染，这显着限制了这些制剂在诱导粘膜免疫应答或解决肺部相关疾病（如囊性纤维化或α1-抗胰蛋白酶缺乏症）中的应用。因此，需要开发一种新型递送系统，以促进气道相关细胞中IVT mRNA的高效递送和转染，以解决这一未满足的需求。
已经证实，肽-泊洛沙明自组装纳米颗粒（PP-sNp）递送系统可以介导小鼠呼吸道中核酸23的有效转染。PP-sNp采用多功能模块化设计方法，可以将不同的功能模块集成到纳米颗粒中，以便快速筛选和优化23。PP-sNp内的合成肽和电中性两亲性嵌段共聚物（泊洛沙明）可以与IVT mRNA自发相互作用，生成结构紧凑、表面光滑均匀分布的纳米颗粒23。PP-sNp可以提高IVT mRNA分子在培养细胞和小鼠呼吸道中的基因转染作用23。本研究描述了一种用于生成含有IVT mRNA的PP-sNp的方案，该MRNA编码甲基化物胺酶（甲基葡糖-mRNA）（图1）。该方案 采用 交错式人字形混合设计的微流体混合装置进行受控和快速混合。该过程易于执行，并允许生成尺寸更均匀的PP-sNp。使用微流体混合器生产PP-sNp的总体目标是以良好控制的方式产生用于mRNA络合的PP-sNp，从而实现高效且可重复 的体外细胞转染。本实验方案描述了含有甲基葡聚糖-mRNA的PP-sNp的制备、组装和表征。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的方案不仅允许具有确定性质的IVT mRNA疫苗制剂的具有成本效益和快速生产，而且还提供了根据特定治疗目的（例如基因治疗）定制PP-sNp制剂的可能性。为了确保IVT mRNA/PP-sNp的成功生成，建议特别注意一些关键步骤。在使用mRNA时，请始终记住，应在整个过程中保持无RNase的条件，因为IVT mRNA对RNase的降解非常敏感，即使IVT mRNA是用化学修饰制备的。同时，在储存配方时，还必须确保无RNase的…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究由国家自然科学基金项目（国家自然科学基金委，批准号82041045和82173764）、国家科技部发病防疫技术体系研究重大专项（2021YFC2302500）、重庆市人才：优秀青年人才项目（CQYC202005027）和重庆市自然科学基金项目（cstc2021jcyj-msxmX0136）资助。作者感谢丁晓燕博士测量的流体动力直径（nm）和多分散指数（PDI）。
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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