Preparação de uma Suspensão de Células Não-Cardiomiócitos para Sequenciamento de RNA de Célula Única de um Coração de Camundongo Adulto Pós-Infarto do Miocárdio
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para isolar uma quantidade suficiente de cardiomiócitos únicos não cardiomiócitos com alta viabilidade de um coração de camundongo pós-infarto do miocárdio (IM). Isso pode ser usado para sequenciamento subsequente de célula única, análise de citometria de fluxo e cultura de células primárias.
Abstract
O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns, com mortalidade crescente em todo o mundo. Os não-cardiomiócitos representam mais da metade da população total de células cardíacas e contribuem para compensações adaptativas em caso de lesão miocárdica, incluindo respostas inflamatórias, reparo tecidual e formação de cicatrizes. Para estudar o microambiente cardíaco pós-IM, o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) é amplamente utilizado para identificar diferentes tipos de células cardíacas e comunicações intercelulares. Dentre os procedimentos de preparação da amostra de scRNA-seq, o preparo da suspensão celular é uma das etapas mais críticas, pois a viabilidade celular pode afetar a qualidade dos resultados do scRNA-seq. Portanto, projetamos um protocolo experimental para preparar uma suspensão de células não-cardiomiócitos de corações de camundongos pós-IM com um foco extra em melhorar a viabilidade celular através da escolha de enzimas digestivas leves, controle do tempo de digestão e aplicação de classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Finalmente, isolamos as células CD45+ da suspensão de células não-cardiomiócitos obtidas através deste protocolo e, em seguida, realizamos scRNA-seq.
Introduction
O infarto do miocárdio (IAM) é uma das doenças cardiovasculares mais comuns e sua mortalidade está aumentando em todo omundo1. O IM é causado por um suprimento sanguíneo insuficiente para o miocárdio circundante, que pode ser resultado de um bloqueio da artéria coronária que ocorre com a ruptura da placa aterosclerótica. Embora a intervenção coronária percutânea (ICP) tenha reduzido as taxas de mortalidade de pacientes com IAM agudo, a alta prevalência de insuficiência cardíaca pós-IAM continua sendo um problema2. A principal fisiopatologia subjacente à insuficiência cardíaca pós-IM é a resposta compensatória do organismo às lesões cardíacas, que envolve a substituição do músculo cardíaco morto por cicatrizes fibróticas não contráteis. Essas respostas adaptativas dependem significativamente da inflamação local mediada pelas interações entre múltiplos tipos celulares e células do tecido cardíaco, e essa inflamação é atualmente considerada como um potencial alvo terapêutico para reduzir a formação de cicatriz fibrótica e, assim, proteger contra a insuficiência cardíacapós-IAM3,4. Curiosamente, o microambiente no local do infarto experimenta uma transição tempo-dependente nos tipos e funções celulares infiltrantes em diferentes estágios do IM 1,5. Muitos estudos têm demonstrado que os não-cardiomiócitos (por exemplo, células imunes, fibroblastos e células endoteliais) desempenham papéis centrais na inflamação pós-infarto agudo do miocárdio e no reparo tecidual 5,6. Nos últimos anos, o sequenciamento unicelular tem sido amplamente utilizado como uma poderosa ferramenta para elucidar o envolvimento e as funções de não-cardiomiócitos no microambiente pós-IM7,8. Isso fornece informações sobre a fisiopatologia da lesão e reparo pós-IM e o desenvolvimento de terapias potenciais contra a insuficiência cardíaca pós-IAM.
O sequenciamento de RNA de alto rendimento (RNA-Seq) é uma técnica usada para estudar transcriptomas inteiros em grande detalhe usando sequenciamento de próxima geração (NGS)7,8,9. Recentemente, o desenvolvimento do scRNA-Seq revolucionou o campo da pesquisa biomédica. Em comparação com o sequenciamento convencional em massa, o scRNA-Seq analisa perfis de expressão gênica e heterogeneidade transcricional em nível unicelular 7,8. Essa técnica promove significativamente a pesquisa da fisiopatologia celular do IM 9,10 ao identificar diferentes tipos celulares circulantes no microambiente pós-IM e desvendar a interação entre cardiomiócitos e não cardiomiócitos. Esses achados contribuem ainda mais para a descoberta de novos alvos terapêuticos para a insuficiência cardíaca pós-IAM. Em geral, o experimento pós-MI baseado em scRNA-seq inclui três seções principais: (1) o estabelecimento do modelo animal pós-IM; (2) a preparação da suspensão celular; e (3) sequenciamento das amostras e análise dos dados. Notavelmente, a preparação da suspensão celular é a etapa mais crítica na preparação do experimento scRNA-Seq, pois a qualidade da suspensão celular determina a precisão dos resultados.
Este protocolo é projetado para extrair uma suspensão de células não-cardiomiócitos do tecido cardíaco pós-IM; Significativamente, os detalhes específicos para manter a viabilidade e resolução da célula são incluídos. Enquanto isso, os equipamentos utilizados nesse protocolo, como kits cirúrgicos para camundongos, ventiladores de roedores e centrífugas, podem ser encontrados na maioria dos centros de experimentação animal e laboratórios biomédicos, e, portanto, o custo do experimento desse protocolo é relativamente baixo. Além disso, se considerados os momentos e locais de infarto como variáveis, esse protocolo pode ser aplicado para simular uma ampla gama de cenários clínicos, especialmente para as complicações pós-IM.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para isolar cardiomiócitos únicos de corações de camundongos pós-IM. O protocolo pode ser aplicado para isolar diferentes tipos de células no microambiente pós-IM com alta qualidade, incluindo células imunes, células endoteliais e fibroblastos. Três fatores essenciais são cruciais para a obtenção de uma suspensão celular de alta qualidade para o sequenciamento de uma única célula. A primeira é a configuração da digestão enzimática. É importante cont…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
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