本协议描述了一种优化的方法,用于组织学观察由 芸苔疟原虫 诱导的瘿。在荧光成像之前清除下胚轴的振动切片,以研究疾病进展过程中转录因子和植物激素的参与。该方案克服了树脂包埋的限制 ,使荧光 蛋白的植物可视化成为可能。
土源原生生物 芸苔 属植物对芸苔属作物的感染导致地下器官形成胆。瘿的形成需要细胞重编程和受感染植物新陈代谢的变化。这对于建立一个面向病原体的生理汇是必要的,宿主营养物质被重定向到该汇。为了全面了解这种特殊的植物 – 病原体相互作用以及宿主生长和发育被颠覆和重塑的机制,必须跟踪和观察伴随细胞分辨率形成胆的内部变化。结合荧光染料和荧光蛋白的方法通常用于研究植物的解剖学和生理反应。不幸的是,胆的大尺寸和低透明度是显微镜下进行整体安装观察的主要障碍。此外,低透明度限制了荧光显微镜研究马蹄根疾病进展和胆形成的应用。本文提出了一种用于固定和清除胆的优化方法,以促进落射荧光和共聚焦显微镜检查 芸苔属细菌感染的胆。使用用于快速光学清除的组织清除方案,然后进行振动切片机切片以检测解剖学变化,并通过启动子融合和用荧光蛋白标记的报告株系定位基因表达。这种方法将被证明可用于研究植物中其他病原体触发结构中的细胞和生理反应,例如线虫诱导的合胞体和根结,以及昆虫引起的叶瘿和变形。
受病原体或昆虫影响的植物可能会发展出异常结构(器官变形或胆),这使得入侵者能够摄取营养并繁殖1。在这里,采用了一种有效的组织病理学方法来研究在感染原生生物 芸苔 属的植物地下部分发育的瘿中发生的变化(图1)。与这种病原体相关的次要线索源于这样一个事实,即 芸苔属松弛孢 子可以保持其入侵植物的能力多年。在大规模种植油菜(Brassica napus)的情况下,这是一个严重的问题,因为经济因素限制了作物轮作,导致土壤中静止孢子堆积2。油菜对 芸苔假单胞 菌引起的马蹄根病的抗性是遗传决定的。可悲的是,这种病原体往往胜过耐药性,因为它的生物学和油菜起源的狭窄基因库。因此,研究寄主植物的感染后反应及其减缓疾病进展或预防某些症状发展的能力变得具有相关性。
在根根病中,严重程度通常根据胆的发育和根系损伤的程度进行评估。这被称为疾病指数-DI3.然而,它并没有完全捕捉到这种植物-病原体相互作用的真实评价。特别是,它没有解决病原体如何在根内分布以及植物是否可以抑制 P. brassicae 在其组织内的运动。此外,不容易预测到什么程度 P. brassicae 重新编程地下器官解剖学。模型工厂研究 Arabidopsis thaliana 已经表明 P. brassicae 感染导致抑制木生成(起始和成熟步骤)和增强瘿内韧皮部分化4,5.此外,在受感染植物的根和下胚轴中,坎比细胞后代不会退出有丝分裂状态并且比健康植物增殖的时间更长6.这个过程控制着胆的最终大小,并确定受感染植物内产生的病原体静息孢子的数量。 P. brassicae-宿主中驱动的发育、代谢和生理重编程非常复杂7;因此,应用允许检查瘿内内部变化的工具对于正确评估这种相互作用至关重要。生命周期进程 P. brassicae 伴随着宿主细胞代谢的重编程,可以观察到淀粉或脂质沉积7,8.成功进行胆镜显微镜检查的主要障碍来自其低透明度。因此,大多数在瘿内呈现马蹄根驱动变化的组织学标本源于固定包埋(蜡或树脂)技术,然后是切片机切片。这些方法成功地用于定位马蹄根瘿中许多活跃基因的启动子活性4,5 或各种染色技术,便于观察 P. brassicae 生命周期进程9.然而,必须注意的是,固定和包埋阶段非常耗时,并且会导致重要生物分子(例如脂质)的部分或完全洗掉,从而严重阻碍某些观察。最近 P. brassicae 在荧光原位杂交(FISH)的帮助下可视化宿主的生命周期进程,其中SABATH型甲基转移酶(PbBSMT)基因特异性探针用于标记静止孢子的形成10.一个好的替代方案是使用其他基于荧光的方法,其中可以看到某些细胞成分的自发荧光,与荧光蛋白标记物融合的基因的5′-上游调控区域的活性以及特定荧光标记蛋白的积累。然而,除了样品的低透明度之外,与此类物体相关的一个主要缺点是使用未固定的标本,这大大减少了记录高质量图像的时间。2015年,栗原等.11 开发了一种透明试剂,可以保存荧光蛋白并增加植物组织标本的透明度。此外,它还与许多组织学染色剂兼容。最近,相同的技术被成功地应用于可视化植物组织中的不同细胞壁成分12,13.在这里,该协议已被用于分析各种马蹄根胆的发展方面。工作流程从瘿的固定、振动切片、组织清除、染色和荧光成像开始。根据个人的需要,直接或在特定染色后,可以在落射荧光或共聚焦显微镜下检查所得切片。该方法为研究基因表达和生理反应的局部变化(包括植物激素平衡和信号传导)提供了有效的解决方案。可以通过观察静息孢子的分布模式和成熟动态来跟踪疾病进展。此外,该协议可以很容易地应用于内部的成像特征变化 P. brassicae 受感染的植物,包括抑制木生成或宿主植物防御反应,在抗性基因型中可见为局部木质化。该协议中的示例来自在 Arabidopsis thaliana 型;但是,该协议也可以适用于属于 Brassicaceae 家庭。下面描述的方法将有助于未来对伴随胆形成的细胞结构和分子变化的详细研究 P. brassicae-受感染的植物。
该方案的一般工作流程非常简单,胆汁发育的所有阶段都可以轻松成像和表征(图2)。由于 芸苔属是一种 土源性病原体,因此所有实验都必须在土壤系统中进行。病原体喜欢酸性条件;因此,必须使用未经石灰处理的土壤基质。虽然 芸苔属不会 对人类构成威胁,但严格来说,它是一种植物病原体,可以通过土壤和水传播。因此,受感染植物的所有部分以及土壤都需要在实验后通过高压灭菌或漂白剂处理来破坏。
将清除溶液应用于瘿的振动切片切片肯定会增强研究 芸苔属假单胞菌 与寄主植物之间生物营养相互作用的能力。尽管清除协议甚至适用于手部部分,但它在振动切片机部分效果更好。将样品固定在PFA固定剂中是方案中的关键步骤,因为样品可以在4°C下储存几天,然后再进行切片。这提供了在有限时间内储存样品的灵活性,而不会影响固定过程中荧光蛋白的表达和保存。
尼罗红(在DMSO或甲醇中)由于其疏水性而与树脂部分不相容,这会溶解树脂并破坏树脂嵌入的部分17。因此,振动切片机切片被证明有助于研究发育中的瘿内的病原体分布及其生命周期,其中尼罗红染色可以很容易地使用。
本协议中使用的清除溶液具有高度通用性12,允许以不同的组合使用各种荧光染料来染色细胞壁的各种生物分子/组分(真菌相互作用中的木栓素,木质素,纤维素和几丁质)。还可以对荧光GFP标记线的部分进行复染,从而将启动子活性或蛋白质积累模式与病原体在特定细胞或胆区域中的存在相关联。然而,即使在清除方案之后,木质部和充满病原体的巨细胞的背景自发荧光也无法消除。这限制了在胆形成后期观察荧光标记物,特别是在使用落射荧光显微镜和对微弱信号进行成像时。
由于荧光信号的表达/积累水平低,转录因子难以检测,但是,使用这种技术,可以获得令人满意的图像。总体而言,将振动切片与组织清除方法相结合,扩展了复杂胆组织组织学观察的工具包。该方案的灵活性简化了组织固定过程,并减少了切割和成像新鲜组织样品以观察荧光蛋白和启动子活性所需的时间。随着进一步的改进,并通过利用针对各种生物分子的其他荧光染料,该方法将标志着具有复杂组织组织的致密,不透明组织的组织学研究和图像分析的更大进展。最近,所提出的组织清除方法已成为一种流行且广泛使用的方案,用于组合并能够同时采集不同的荧光信号11,12,13。这些技术的未来发展和修改将大大提高在细胞水平上观察植物 – 病原体相互作用的图像分辨率。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了波兰国家科学中心OPUS17资助号2019/33/B/NZ9/00751“ 芸苔疟原虫感染植物的长距离血管协调”的支持。我们感谢Yrjö Helariutta教授(剑桥大学塞恩斯伯里实验室)分享 proHCA2::erRFP 系列。
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |