Le présent protocole décrit une méthode optimisée pour l’observation histologique des galles induites par Plasmodiophora brassicae. Les sections de vibratomes d’hypocotyles sont éliminées avant l’imagerie par fluorescence pour étudier l’implication des facteurs de transcription et des phytohormones au cours de la progression de la maladie. Ce protocole surmonte les limitations d’incorporation de résine, permettant la visualisation in planta de protéines fluorescentes.
L’infection des cultures de Brassica par le protiste terricole Plasmodiophora brassicae entraîne la formation de galles sur les organes souterrains. La formation de galles nécessite une reprogrammation cellulaire et des changements dans le métabolisme de la plante infectée. Ceci est nécessaire pour établir un puits physiologique axé sur les agents pathogènes vers lequel les nutriments de l’hôte sont redirigés. Pour une compréhension complète de cette interaction phytopathogène particulière et des mécanismes par lesquels la croissance et le développement de l’hôte sont subvertis et remodelés, il est essentiel de suivre et d’observer les changements internes accompagnant la formation de la galle avec une résolution cellulaire. Des méthodes combinant des colorations fluorescentes et des protéines fluorescentes sont souvent utilisées pour étudier les réponses anatomiques et physiologiques chez les plantes. Malheureusement, la grande taille des galles et leur faible transparence constituent des obstacles majeurs à la réalisation d’observations complètes au microscope. De plus, la faible transparence limite l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier la progression de la hernie et la formation de galles. Cet article présente une méthode optimisée pour fixer et éliminer les galles afin de faciliter l’épifluorescence et la microscopie confocale pour l’inspection des galles infectées par P. brassicae. Un protocole de nettoyage tissulaire pour une clairance optique rapide a été utilisé, suivi d’une section de vibratomes pour détecter les changements anatomiques et localiser l’expression génique avec des fusions de promoteurs et des lignes rapporteures marquées avec des protéines fluorescentes. Cette méthode s’avérera utile pour étudier les réponses cellulaires et physiologiques dans d’autres structures déclenchées par des agents pathogènes chez les plantes, telles que les syncyties induites par les nématodes et les nœuds racinaires, ainsi que les galles des feuilles et les déformations causées par les insectes.
Les plantes touchées par des agents pathogènes ou des insectes peuvent développer des structures anormales (déformations d’organes ou galles), qui permettent à l’envahisseur d’ingérer des nutriments et de se reproduire1. Ici, une approche histopathologique efficace a été entreprise pour étudier les changements qui se produisent dans les galles qui se développent sur les parties souterraines des plantes infectées par le protiste Plasmodiophora brassicae (Figure 1). Le fil mineur associé à cet agent pathogène provient du fait que les spores au repos de P. brassicae peuvent conserver leur capacité à envahir les plantes pendant de nombreuses années. Dans le cas de la culture à grande échelle du colza (Brassica napus), il s’agit d’un problème grave car des facteurs économiques limitent la rotation des cultures, ce qui entraîne une accumulation de spores au repos dans le sol2. La résistance du colza à la hernie causée par P. brassicae est déterminée génétiquement. Malheureusement, l’agent pathogène surpasse souvent la résistance en raison de sa biologie et du pool génétique étroit d’où provient le colza. Par conséquent, il est devenu pertinent d’étudier les réponses post-infection chez les plantes hôtes et leur capacité à ralentir la progression de la maladie ou à prévenir l’apparition de certains symptômes.
Dans la hernie de la maladie de la hernie, la gravité est généralement évaluée en fonction du développement de galles et du degré de lésion du système racinaire. C’est ce qu’on appelle l’indice de maladie-DI3. Cependant, il ne saisit pas entièrement la véritable évaluation de cette interaction phytopathogène. En particulier, il n’aborde pas la façon dont l’agent pathogène est distribué dans les racines et si la plante peut se retenir P. brassicae mouvement à l’intérieur de ses tissus. De plus, il n’est pas facile de prévoir dans quelle mesure P. brassicae reprogramme l’anatomie des organes souterrains. Études sur la plante modèle Arabidopsis thaliana ont montré que P. brassicae L’infection conduit à l’inhibition de la xylogenèse (à la fois les étapes d’initiation et de maturation) et l’amélioration de la différenciation du phloème dans les galles4,5. De plus, dans les racines et les hypocotyles des plantes infectées, la descendance des cellules cambiales ne quitte pas l’état mitotique et prolifère plus longtemps que chez les plantes saines6. Ce processus régit la taille finale de la galle et détermine le nombre de spores pathogènes au repos produites dans la plante infectée. P. brassicaeLa reprogrammation développementale, métabolique et physiologique chez l’hôte est très complexe7; Par conséquent, l’application d’outils permettant l’inspection des changements internes dans les GALL est cruciale pour évaluer correctement cette interaction. La progression du cycle de vie de P. brassicae s’accompagne d’une reprogrammation du métabolisme de la cellule hôte, qui peut être observée sous forme de dépôt d’amidon ou de lipides7,8. Le principal obstacle à la réussite de la microscopie des galles provient de leur faible transparence. Pour cette raison, la majorité des spécimens histologiques présentant des changements induits par la hernie dans les galles proviennent de techniques de fixation-enrobage (cire ou résine) suivies d’une section microtome. De telles approches ont été utilisées avec succès pour localiser l’activité promotrice de nombreux gènes actifs dans les galles de la hernie4,5 ou diverses techniques de coloration facilitant l’observation de P. brassicae Progression du cycle de vie9. Cependant, il faut noter que les étapes de fixation et d’encastrement prennent beaucoup de temps et entraînent un lavage partiel ou complet de biomolécules importantes (p. ex. lipides), ce qui entrave considérablement certaines observations. Récemment P. brassicae La progression du cycle de vie chez l’hôte a été visualisée à l’aide de l’hybridation fluorescente in situ (FISH), dans laquelle une méthyltransférase de type SABATH (PbBSMT) a été utilisée pour marquer la formation de spores au repos10. Une bonne alternative est l’utilisation d’autres méthodes basées sur la fluorescence où l’autofluorescence de certains composants cellulaires, l’activité des régions régulatrices 5′- en amont des gènes fusionnés à des marqueurs protéiques fluorescents et l’accumulation de protéines marquées par fluorescence particulières peuvent être observées. Cependant, en plus de la faible transparence des échantillons, un inconvénient majeur associé à de tels objets est de travailler avec des spécimens non fixés, ce qui réduit considérablement le temps pendant lequel des images de bonne qualité peuvent être documentées. En 2015, Kurihara et al.11 Développement d’un réactif de nettoyage, qui permet la préservation des protéines fluorescentes et augmente la transparence des échantillons de tissus végétaux. De plus, il est compatible avec de nombreuses taches histologiques. Récemment, la même technique a été appliquée avec succès pour visualiser différents composants de la paroi cellulaire dans les tissus végétaux.12,13. Ici, ce protocole a été utilisé pour analyser divers aspects du développement de la galle de la hernie. Le flux de travail commence par la fixation des galles, la section des vibratomes, l’élimination des tissus, la coloration et l’imagerie par fluorescence. Selon les besoins, directement ou après coloration particulière, les coupes résultantes peuvent être soumises à une inspection sous épifluorescence ou microscope confocale. Cette méthode fournit une solution efficace pour étudier les changements locaux dans l’expression des gènes et les réponses physiologiques, y compris l’équilibre et la signalisation phytohormonale. La progression de la maladie peut être suivie en examinant le modèle de distribution des spores au repos et la dynamique de maturation. En outre, le protocole peut être facilement appliqué pour les changements de caractéristiques d’imagerie dans P. brassicae plantes infectées, y compris l’inhibition de la xylogenèse ou les réponses de défense de la plante hôte visibles sous forme de lignification locale dans les génotypes résistants. Les exemples de ce protocole proviennent de l’imagerie effectuée sur le Arabidopsis thaliana modèle; Toutefois, le protocole peut également s’appliquer à d’autres espèces cultivées appartenant à la Brassicaceae Famille. La méthode décrite ci-dessous facilitera les futures études détaillées des structures cellulaires et des changements moléculaires accompagnant la formation de galles chez les P. brassicae-plantes infectées.
Le flux de travail général du protocole est assez simple et toutes les étapes du développement de la galle peuvent être facilement imagées et caractérisées (Figure 2). Étant donné que P. brassicae est un agent pathogène transmis par le sol, toutes les expériences doivent être effectuées dans des systèmes basés sur le sol. L’agent pathogène préfère les conditions acides; Par conséquent, des substrats de sol non traités à la chaux doivent être utilisés. Bien que P. brassicae ne constitue pas une menace pour les humains, il s’agit strictement d’un phytopathogène qui peut se propager dans le sol et l’eau. Par conséquent, toutes les parties de la plante infectée, ainsi que le sol, doivent être détruits après l’expérience par autoclavage ou par traitement à l’eau de Javel.
L’application de la solution de nettoyage sur des sections de galles coupées par vibratome améliore certainement la capacité d’étudier l’interaction biotrophique entre P. brassicae et la plante hôte. Bien que le protocole de dégagement s’applique même aux sections de main, il fonctionne mieux avec les sections de vibratome. La fixation des échantillons dans un fixateur PFA constitue une étape critique du protocole, car les échantillons peuvent ensuite être conservés à 4 °C pendant quelques jours avant de procéder à la section. Cela offre la flexibilité nécessaire pour stocker les échantillons pendant une période limitée sans compromettre l’expression et la préservation des protéines fluorescentes pendant la fixation.
Le rouge du Nil (dans le DMSO ou le méthanol) est incompatible avec les sections de résine en raison de son hydrophobicité, qui dissout la résine et détruit les sections incorporées dans la résine17. Ainsi, les sections de vibratomes s’avèrent essentielles pour étudier la distribution des agents pathogènes et leur cycle de vie dans les galles en développement, dans lesquelles la coloration rouge du Nil peut être facilement utilisée.
La solution de compensation utilisée dans ce protocole est très polyvalente12, permettant d’utiliser une variété de colorants de fluorescence dans différentes combinaisons pour colorer diverses biomolécules / composants des parois cellulaires (subérine, lignine, cellulose et chitine dans les interactions fongiques). Il est également possible de contre-colorer des sections de lignées marqueurs fluorescentes de la GFP et de corréler ainsi l’activité promotrice ou le schéma d’accumulation de protéines avec la présence de l’agent pathogène dans des cellules ou des régions particulières de la galle. Cependant, l’autofluorescence de fond du xylème et des cellules géantes remplies d’agents pathogènes n’a pas pu être éliminée même après le protocole de nettoyage. Cela présente une limite pour l’examen des marqueurs fluorescents au cours des dernières étapes de la formation de la galle, en particulier lors de l’utilisation d’un microscope à épifluorescence et de l’imagerie des signaux faibles.
En raison des faibles niveaux d’expression / accumulation de signaux fluorescents, les facteurs de transcription sont difficiles à détecter, mais, avec cette technique, il est possible d’obtenir des images satisfaisantes pour eux. Dans l’ensemble, la combinaison de la section des vibratomes avec l’approche de nettoyage des tissus élargit la boîte à outils pour les observations histologiques des tissus biliaires complexes. La flexibilité de ce protocole facilite le processus de fixation des tissus et réduit le temps nécessaire à la découpe et à l’imagerie des échantillons de tissus frais pour observer les protéines fluorescentes et les activités de promotion. Avec d’autres améliorations et en utilisant d’autres colorants fluorescents spécifiques à diverses biomolécules, cette méthode marquera de plus grands progrès dans les études histologiques et l’analyse d’images de tissus denses et opaques avec une organisation tissulaire complexe. Ces derniers temps, la méthode de nettoyage tissulaire présentée est devenue un protocole populaire et largement utilisé pour combiner et permettre l’acquisition simultanée de différents signaux fluorescents11,12,13. Le développement et les modifications futurs de ces techniques amélioreront considérablement la résolution de l’image pour observer les interactions plantes-pathogènes au niveau cellulaire.
The authors have nothing to disclose.
Le travail a été soutenu par la subvention OPUS17 du Centre national des sciences de Pologne n ° 2019/33 / B / NZ9 / 00751 « Coordination vasculaire à longue distance chez les plantes infectées par Plasmodiophora brassicae ». Nous remercions le professeur Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, Université de Cambridge) d’avoir partagé la ligne proHCA2::erRFP .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |