Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for histologisk observasjon av galler indusert av Plasmodiophora brassicae. Vibratome seksjoner av hypokotyler fjernes før fluorescensavbildning for å studere involvering av transkripsjonsfaktorer og fytohormoner under sykdomsprogresjon. Denne protokollen overvinner harpiksinnbyggingsbegrensninger, noe som muliggjør visualisering av fluorescerende proteiner i planta .
Infeksjon av Brassica-avlinger av den jordbårne protisten Plasmodiophora brassicae fører til galldannelse på de underjordiske organene. Dannelsen av galler krever cellulær omprogrammering og endringer i metabolismen til den infiserte planten. Dette er nødvendig for å etablere en patogenorientert fysiologisk vask som vertsnæringsstoffene omdirigeres mot. For en fullstendig forståelse av denne spesielle plantepatogeninteraksjonen og mekanismene som vertsvekst og utvikling undergraves og remønstres, er det viktig å spore og observere de interne endringene som følger med galledannelse med cellulær oppløsning. Metoder som kombinerer fluorescerende flekker og fluorescerende proteiner brukes ofte til å studere anatomiske og fysiologiske responser i planter. Dessverre fungerer den store størrelsen på galls og deres lave gjennomsiktighet som store hindringer for å utføre helmonterte observasjoner under mikroskopet. Videre begrenser lav gjennomsiktighet bruken av fluorescensmikroskopi for å studere clubroot sykdomsprogresjon og galldannelse. Denne artikkelen presenterer en optimalisert metode for å fikse og rydde galls for å lette epifluorescens og konfokal mikroskopi for inspeksjon av P. brassicae-infiserte galls. En vevsklareringsprotokoll for rask optisk clearing ble brukt etterfulgt av vibratomseksjonering for å oppdage anatomiske endringer og lokalisere genuttrykk med promotorfusjoner og reporterlinjer merket med fluorescerende proteiner. Denne metoden vil vise seg nyttig for å studere cellulære og fysiologiske responser i andre patogenutløste strukturer i planter, som nematodindusert syncytia og rotknuter, samt bladgaller og deformasjoner forårsaket av insekter.
Planter påvirket av patogener eller insekter kan utvikle unormale strukturer (organdeformasjoner eller galler), som tillater inntrengeren å innta næringsstoffer og reprodusere1. Her ble det gjennomført en effektiv histopatologisk tilnærming for å studere endringene som foregår i galler som utvikler seg på de underjordiske delene av planter infisert med protisten Plasmodiophora brassicae (figur 1). Den mindre tråden forbundet med dette patogenet kommer fra det faktum at P. brassicae hvilesporer kan beholde sin evne til å invadere planter i mange år. Ved storskala dyrking av oljefrøraps (Brassica napus) er dette et alvorlig problem siden økonomiske faktorer begrenser vekslingen, noe som fører til hvilesporeakkumulering i jorda2. Oljefrørapsens motstand mot klubbrotsykdom forårsaket av P. brassicae er genetisk bestemt. Dessverre overlister patogenet ofte motstand på grunn av sin biologi og det smale genetiske bassenget som oljefrøraps stammer fra. Derfor har det blitt relevant å studere responsene etter infeksjon hos vertsplanter og deres evne til å bremse sykdomsprogresjonen eller forhindre at visse symptomer utvikler seg.
I clubroot sykdom vurderes alvorlighetsgraden generelt basert på utviklingen av galls og graden av rotsystemskade. Dette er kjent som sykdomsindeksen-DI3. Det fanger imidlertid ikke fullt ut den sanne vurderingen av denne plantepatogeninteraksjonen. Spesielt tar det ikke opp hvordan patogenet fordeles i røttene, og om planten kan begrense seg. P. brassicae bevegelse i vevet. Videre er det ikke lett å forutse i hvilken grad P. brassicae omprogrammerer underjordisk orgelanatomi. Studier på modellanlegget Arabidopsis thaliana har vist at P. brassicae infeksjon fører til hemming av xylogenese (både initierings- og modningstrinn) og forbedring av floemdifferensiering i galler4,5. Videre, i røtter og hypokotyler av infiserte planter, slutter ikke cambial celle avkom mitotisk tilstand og sprer seg lenger enn i sunne planter.6. Denne prosessen styrer den endelige størrelsen på gallen og bestemmer antall patogen hvilesporer produsert i den infiserte planten. P. brassicae-drevet utviklingsmessig, metabolsk og fysiologisk omprogrammering i verten er svært kompleks7; Derfor er anvendelsen av verktøy som tillater inspeksjon av interne endringer i Galls avgjørende for riktig vurdering av denne interaksjonen. Livssyklusprogresjonen til P. brassicae er ledsaget av omprogrammering av vertscellemetabolismen, som kan observeres som stivelse eller lipidavsetning7,8. Hovedhindringen for vellykket mikroskopi av galls kommer fra deres lave gjennomsiktighet. På grunn av dette stammer flertallet av histologiske prøver som presenterer klubbrotdrevne endringer innen galler fra fikseringsinnlemming (voks eller harpiks) teknikker etterfulgt av mikrotomseksjonering. Slike tilnærminger ble vellykket brukt til å lokalisere promotoraktiviteten for mange gener som er aktive i klubbrotgaller.4,5 eller ulike fargeteknikker som letter observasjonen av P. brassicae Progresjon i livssyklusen9. Det må imidlertid bemerkes at fikserings- og innebyggingstrinnene er tidkrevende og resulterer i delvis eller fullstendig utvasking av viktige biomolekyler (f.eks. Lipider), noe som betydelig hindrer visse observasjoner. Nylig P. brassicae livssyklusprogresjon i verten ble visualisert ved hjelp av fluorescerende In Situ Hybridization (FISH), der en SABATH-type metyltransferase (PbBSMT) genspesifikk sonde ble brukt for å markere hvilesporedannelse10. Et godt alternativ er bruk av andre fluorescensbaserte metoder der autofluorescensen til noen cellulære komponenter, aktiviteten til 5′- oppstrøms regulatoriske regioner av gener smeltet sammen med fluorescerende proteinmarkører, og akkumulering av bestemte fluorescerende merkede proteiner kan sees. I tillegg til prøvenes lave gjennomsiktighet arbeider imidlertid en stor ulempe forbundet med slike objekter med ufikserte prøver, noe som reduserer tiden der bilder av god kvalitet kan dokumenteres. I 2015, Kurihara et al.11 utviklet et clearingreagens, som tillater bevaring av fluorescerende proteiner og øker gjennomsiktigheten av plantevevsprøver. I tillegg er den kompatibel med mange histologiske flekker. Nylig ble den samme teknikken vellykket brukt for å visualisere forskjellige celleveggkomponenter i plantevev.12,13. Her har denne protokollen blitt brukt til å analysere ulike clubroot gall utviklingsaspekter. Arbeidsflyten begynner med fiksering av galler, vibratomseksjonering, vevsrydding, farging og fluorescensbilder. Avhengig av ens behov, direkte eller etter spesiell farging, kan de resulterende delene bli utsatt for inspeksjon under en epifluorescens eller konfokalt mikroskop. Denne metoden gir en effektiv løsning for å studere lokale endringer i genuttrykk og fysiologiske responser, inkludert fytohormonbalanse og signalering. Sykdomsprogresjon kan spores ved å se på distribusjonsmønsteret til hvilesporer og modningsdynamikk. Videre kan protokollen enkelt brukes til å avbilde karakteristiske endringer innen P. brassicae infiserte planter, inkludert hemming av xylogenese eller vertsplanteforsvarsresponser synlig som lokal lignifisering i resistente genotyper. Eksempler i denne protokollen kommer fra bildebehandling utført på Arabidopsis thaliana modell; Protokollen kan imidlertid også anvendes på andre avlingsarter som tilhører Brassicaceae familie. Metoden beskrevet nedenfor vil legge til rette for fremtidige detaljerte studier av cellulære strukturer og molekylære endringer som følger med galledannelse i P. brassicae-infiserte planter.
Den generelle arbeidsflyten til protokollen er ganske grei, og alle stadier av gallutvikling kan enkelt avbildes og karakteriseres (figur 2). Siden P. brassicae er et jordbårent patogen, må alle eksperimenter utføres i jordbaserte systemer. Patogenet foretrekker sure forhold; Derfor må ikke-kalkbehandlede jordsubstrater brukes. Selv om P. brassicae ikke utgjør en trussel mot mennesker, er det strengt tatt et plantepatogen som kan spre seg gjennom jord og vann. Derfor må alle deler av den infiserte planten, så vel som jorda, ødelegges etter forsøket ved autoklavering eller ved behandling med blekemiddel.
Påføring av clearingløsningen på vibratomkuttede deler av galler forbedrer sikkert evnen til å studere det biotrofiske samspillet mellom P. brassicae og vertsplanten. Selv om clearingprotokollen gjelder selv for håndseksjoner, fungerer den bedre med vibratomseksjoner. Fikseringsprøver i PFA-fikseringsmiddel fungerer som et kritisk trinn i protokollen, da prøver deretter kan lagres ved 4 °C i noen dager før de fortsetter med seksjonering. Dette gir fleksibilitet til å lagre prøver i en begrenset periode uten at det går ut over uttrykket og bevaringen av fluorescerende proteiner under fiksering.
Nile Red (i DMSO eller metanol) er uforenlig med harpiksseksjoner på grunn av dets hydrofobisitet, som oppløser harpiks og ødelegger harpiksinnstøpte seksjoner17. Dermed viser vibratomeseksjoner seg å være medvirkende til å studere patogenfordelingen og dens livssyklus i utviklende galler, hvor Nile Red-farging lett kan brukes.
Clearingløsningen som brukes i denne protokollen er svært allsidig12, slik at en rekke fluorescensflekker kan brukes i forskjellige kombinasjoner for å flekke forskjellige biomolekyler / komponenter i celleveggene (suberin, lignin, cellulose og kitin i soppinteraksjoner). Det er også mulig å motvirke deler av fluorescerende GFP-markørlinjer og derved korrelere promotoraktiviteten eller proteinakkumuleringsmønsteret med tilstedeværelsen av patogenet i bestemte celler eller regioner i gallen. Imidlertid kunne bakgrunnsautofluorescens fra xylem og patogenfylte gigantiske celler ikke elimineres selv etter clearingprotokollen. Dette gir en begrensning for å se på fluorescerende markører i de senere stadiene av galldannelse, spesielt når du bruker et epifluorescensmikroskop og avbilder svake signaler.
På grunn av de lave nivåene av ekspresjon/akkumulering av fluorescerende signaler er transkripsjonsfaktorer vanskelige å oppdage, men med denne teknikken er det mulig å oppnå tilfredsstillende bilder for dem. Samlet sett utvider kombinasjonen av vibratomseksjonering med vevsryddingsmetoden verktøysettet for histologiske observasjoner av komplekse gallevev. Fleksibiliteten til denne protokollen letter prosessen med vevfiksering og reduserer tiden som kreves for kutting og avbildning av ferske vevsprøver for å observere fluorescerende proteiner og promotoraktiviteter. Med ytterligere forbedringer og ved å bruke andre fluorescerende fargestoffer som er spesifikke for forskjellige biomolekyler, vil denne metoden markere større fremskritt i histologiske studier og bildeanalyse av tette, ugjennomsiktige vev med kompleks vevsorganisasjon. I nyere tid har den presenterte vevsryddingsmetoden dukket opp som en populær og mye brukt protokoll for å kombinere og muliggjøre samtidig oppkjøp av forskjellige fluorescerende signaler11,12,13. Fremtidig utvikling og modifikasjoner i slike teknikker vil i stor grad forbedre bildeoppløsningen for å observere plantepatogeninteraksjoner på mobilnivå.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av National Science Centre Poland OPUS17 grant No. 2019/33/B/NZ9/00751 “Long distance Vascular Coordination in Plants Infected by Plasmodiophora brassicae“. Vi takker prof. Yrjö Helariutta (Sainsbury Laboratory, University of Cambridge) for å dele proHCA2::erRFP-linjen .
2N Sulfuric acid (H2SO4) | Roth | UN2796 | pH adjustment |
Agarose | PRONA | BGQT100 | Embedding |
Basic Fuchsin | BIOSHOP | BSF410.5 | Fluorescent dye |
Calcofluor White | Sigma Aldrich | 18909-100ML-F | Fluorescent dye |
Commercial Bleach | Domestos | ||
Cyanoacrylate/ Instant glue | Kropelka | Adhesive | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | BIOSHOP | DMS555.500 | Solvent |
Epifluorescence microscope | Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system | Carl Zeiss M2 | Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used |
Fully automated Vibratome | Leica | VT1200 S | |
Lightmeter /Photometer | LI-COR Biosciences | LI-250A + LI-190R quantum sensor | For measuring light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband |
Masking tape | For sticking agarose block on mould | ||
Murashige & Skoog Medium (MS Medium) | Duchefa Biochemie | MO222.0050 | Plant Growth Medium |
Nile Red | Sigma Aldrich | N3013-100MG | Fluorescent dye |
Paraformaldehyde PFA | Sigma Aldrich | 158127-100G | Fixative |
Potassium Chloride (KCl) | POCH | 739740114 | PBS component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | P1767-250G | pH adjustment |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | BIOSHOP | PPM302.500 | PBS component |
Sodium chloride (NaCl) | BIOSHOP | SOD001.1 | PBS component |
Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-25G | Clearing Solution |
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O) | POCH | 799490116 | PBS component |
Triton X-100 | BIOSHOP | TRX506.100 | Fixative |
Urea | Sigma Aldrich | U5378-100G | Clearing Solution |
Vacuum/Pressure pump and Dessicator | Welch by Gardner Denver | 2522C-02 | For Vacuum Infilteration |
Xylitol | Sigma Aldrich | X3375-25G | Clearing Solution (componenet) |