التحضير والخصائص والسمية وتقييم الفعالية للقاح ورم مستحلب نانوي ذاتي التجميع ذاتيا في المختبر وفي الجسم الحي
Summary
هنا ، نقدم طرقا مفصلة لإعداد وتقييم لقاح ورم مستحلب نانوي ذاتي التركيب في المختبر وفي الجسم الحي.
Abstract
جذبت الببتيدات Epitope اهتماما واسع النطاق في مجال لقاحات الأورام بسبب سلامتها وخصوصيتها العالية وإنتاجها المريح. على وجه الخصوص ، يمكن لبعض الحواتم المقيدة ب MHC I أن تحفز نشاط الخلايا الليمفاوية التائية السامة الفعالة لإزالة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد إدارة الأنف تقنية توصيل فعالة وآمنة للقاحات الأورام نظرا لملاءمتها وتحسين امتثال المريض. ومع ذلك ، فإن الببتيدات الخاتمة غير مناسبة للولادة الأنفية بسبب ضعف مناعتها ونقص كفاءة التوصيل. المستحلبات النانوية (NEs) هي أنظمة مستقرة ديناميكيا حراريا يمكن تحميلها بالمستضدات وتسليمها مباشرة إلى سطح الغشاء المخاطي للأنف. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) هو الخماسي الأساسي للامينين ، وهو ببتيد ملزم بالأنتغرين تعبر عنه الخلايا الظهارية التنفسية البشرية. في هذه الدراسة ، تم تحضير لقاح ورم الببتيد NE ذاتي التجميع ذاتيا للأنف يحتوي على الببتيد الاصطناعي IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) بطريقة استحلاب منخفضة الطاقة. يمكن أن يؤدي الجمع بين IKVAV و OVA257-264 إلى تعزيز امتصاص المستضد بواسطة الخلايا الظهارية المخاطية للأنف. هنا ، نضع بروتوكولا لدراسة الخصائص الفيزيائية والكيميائية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، ومجهر القوة الذرية (AFM) ، وتشتت الضوء الديناميكي (DLS) ؛ الاستقرار في وجود بروتين الميوسين. السمية من خلال فحص صلاحية الخلايا لخلايا BEAS-2B وأنسجة الأنف والرئة للفئران C57BL / 6 ؛ الامتصاص الخلوي بواسطة مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM) ؛ الافراج عن ملامح عن طريق تصوير الحيوانات الصغيرة في الجسم الحي ؛ والتأثير الوقائي والعلاجي للقاح باستخدام نموذج E.G7 الحامل للورم. نتوقع أن يوفر البروتوكول أدلة تقنية ونظرية للتطوير المستقبلي للقاحات الغشاء المخاطي الببتيد الببتيد الجديدة للخلايا التائية.
Introduction
باعتبارها واحدة من أهم ابتكارات الصحة العامة ، تلعب اللقاحات دورا رئيسيا في مكافحة العبء العالمي للأمراض البشرية1. على سبيل المثال ، في الوقت الحاضر ، يتم اختبار أكثر من 120 لقاحا مرشحا لأمراض COVID-19 ، تمت الموافقة على بعضها في العديد من البلدان2. تشير التقارير الأخيرة إلى أن لقاحات السرطان قد حسنت بشكل فعال تقدم علاجات السرطان السريرية لأنها توجه الجهاز المناعي لمرضى السرطان للتعرف على المستضدات على أنها غريبة على الجسم3. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام العديد من حوامل الخلايا التائية الموجودة داخل أو خارج الخلايا السرطانية لتصميم لقاحات الببتيد ، والتي أظهرت مزايا في علاج السرطانات النقيلي بسبب نقص السمية الكبيرة المرتبطة بالعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي 4,5. منذ منتصف تسعينيات القرن العشرين ، أجريت التجارب قبل السريرية والسريرية لعلاج الورم بشكل رئيسي باستخدام لقاحات الببتيد المستضد ، ولكن القليل من اللقاحات تظهر تأثير علاجي مناسب على مرضى السرطان6. علاوة على ذلك ، فإن لقاحات السرطان التي تحتوي على حوامل الببتيد لديها مناعة ضعيفة وكفاءة توصيل غير كافية ، وقد يكون ذلك بسبب التدهور السريع للببتيدات خارج الخلية التي تنتشر بسرعة من موقع الإعطاء ، مما يؤدي إلى عدم كفاية امتصاص الخلايا المناعيةللمستضد 7. لذلك ، من الضروري التغلب على هذه العقبات باستخدام تكنولوجيا توصيل اللقاحات.
OVA 257-264 ، حاتمة MHC من الفئة الأولى257-264 المعبر عنها كبروتين اندماج ، هي نموذج8 مستخدم بشكل متكرر. بالإضافة إلى ذلك ، يعد OVA257-264 أمرا بالغ الأهمية للاستجابة المناعية التكيفية ضد الأورام ، والتي تعتمد على استجابة الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL). يتم التوسط فيه بواسطة خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد في الورم ، والتي يسببها ببتيد OVA257-264 . يتميز بعدم كفاية الجرانزيم B ، الذي تطلقه الخلايا التائية السامة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمجللخلايا المستهدفة 8. ومع ذلك ، فإن إعطاء الببتيد OVA257-264 المجاني قد يحفز القليل من نشاط CTL لأن امتصاص هذه المستضدات يحدث في خلايا غير محددة بدلا من الخلايا المقدمة للمستضد (APCs). يؤدي نقص التحفيز المناعي المناسب إلى نشاط CTL5. لذلك ، يتطلب تحريض نشاط CTL الفعال تقدما كبيرا.
بسبب الحاجز الذي توفره الخلايا الظهارية والإفراز المستمر للمخاط ، تتم إزالة مستضدات اللقاح بسرعة من مخاط الأنف 9,10. يعد تطوير ناقل لقاح فعال يمكنه المرور عبر الأنسجة المخاطية أمرا بالغ الأهمية لأن الخلايا المقدمة للمستضد تقع تحت ظهارة الغشاء المخاطي9. الحقن عن طريق الأنف من اللقاحات يحفز نظريا مناعة الغشاء المخاطي لمكافحة عدوى الغشاء المخاطي11. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التسليم الأنفي طريقة فعالة وآمنة لإدارة اللقاحات نظرا لملاءمتها ، وتجنب الإدارة المعوية ، وتحسين امتثال المريض7. لذلك ، فإن الولادة الأنفية هي وسيلة جيدة لإعطاء اللقاح النانوي الببتيد الجديد.
تم ابتكار العديد من المواد الحيوية الاصطناعية للجمع بين حواجز الأنسجة الخلوية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. تم إدخال بعض البروتينات النشطة بيولوجيا ، مثل Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ، كجزء من بنية الهيدروجيل لمنح النشاط الحيوي12. من المحتمل أن يساهم هذا الببتيد في ارتباط الخلية والهجرة والنمو13 ويربط الإنتغرينات α 3β1 وα 6β1 للتفاعل مع أنواع الخلايا السرطانية المختلفة. IKVAV هو ببتيد التصاق خلوي مشتق من سلسلة بروتين الغشاء القاعدي اللامينينα 1 التي كانت تستخدم في الأصل لنمذجة البيئة المكروية العصبية وتسبب التمايز العصبي14. لذلك ، فإن العثور على وسيلة توصيل فعالة لهذا اللقاح الجديد أمر مهم لمكافحة المرض.
كما تم تركيب أنظمة المستحلب المبلغ عنها مؤخرا ، مثل W805EC و MF59 ، لتوصيل تجويف الأنف للقاح الأنفلونزا المعطل أو المستضد السطحي لالتهاب الكبد B المؤتلف وتوضيحها لتحفيز كل من المناعة المخاطية والجهازية15. تتميز المستحلبات النانوية (NEs) بمزايا الإدارة السهلة والتشكيل المشترك المريح مع المواد المساعدة الفعالة مقارنة بأنظمة توصيل الجسيمات المخاطية16. تم الإبلاغ عن لقاحات المستحلب النانوي لتغيير النمط الظاهري التحسسي بطريقة مستدامة تختلف عن إزالة التحسس التقليدية ، مما يؤدي إلى تأثيرات قمعية طويلة المدى17. أفاد آخرون أن المستحلبات النانوية جنبا إلى جنب مع المستضدات المناعية المهيمنة الخاصة ب MTB يمكن أن تحفز استجابات قوية للخلايا المخاطية وتمنح حماية كبيرة18. لذلك ، تم تصميم لقاح نانوي جديد ذاتي التجميع داخل الأنف مع الببتيد الاصطناعي IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA ، الببتيد الذي يتكون من IKVAV المرتبط ب OVA257-264). من المهم تقييم هذا اللقاح النانوي الجديد بشكل منهجي.
الغرض من هذا البروتوكول هو إجراء تقييم منهجي للخصائص الفيزيائية والكيميائية والسمية واستقرار اللقاح النانوي ، واكتشاف ما إذا كان امتصاص المستضد والآثار الوقائية والعلاجية يتم تعزيزها باستخدام الوسائل التقنية ، وتوضيح المحتويات التجريبية الرئيسية. في هذه الدراسة ، أنشأنا سلسلة من البروتوكولات لدراسة الخصائص الفيزيائية والكيميائية والاستقرار ، وتحديد حجم سمية خلايا I-OVA NE إلى BEAS-2B بواسطة CCK-8 ، ومراقبة قدرة خلايا BEAS-2B على تقديم المستضد للقاح باستخدام المجهر متحد البؤر ، وتقييم ملامح إطلاق هذا اللقاح النانوي الجديد في الجسم الحي وفي المختبر، والكشف عن التأثير الوقائي والعلاجي لهذا اللقاح باستخدام نموذج الفأر الحامل للورم E.G7-OVA.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمتع اللقاحات النانوية التي تعمل بأغشية الخلايا المناعية بمزايا كبيرة في العلاج الموجه للأمراض ، ويتم تقليل الآثار الجانبية من خلال خصائص مثل الانتحاء الفريد للورم ، وتحديد أهداف محددة ، والدورة الدموية المطولة ، والتفاعلات المحسنة بين الخلايا ، والسمية الجهازية المنخفضة. يمكن أيضا دم…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل رقم 31670938 ، 32070924 ، 32000651 من برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، رقم 2014jcyjA0107 ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ ، رقم 2020XBK24 ورقم 2020XBK26 من المشاريع الخاصة بجامعة الجيش الطبية ، ورقم 202090031021 ورقم 202090031035 من البرنامج الوطني للابتكار وريادة الأعمال لطلاب الجامعات.
Materials
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | Bio-Rad 6.0 | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30088.03 | |
| FITC-labeled I-OVA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | NA | |
| HPLC | Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. | E2695 | |
| Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| IPC-208 | Chong Qing University, China | NA | |
| IVIS system | Caliper Life Science Limited Company | NA | |
| JEM-1230 TEM | JEOL Limited Company of Japan | 1230 TEM | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | NA | |
| MPLA | Invivogen Lit. Co. |
tlrl-mpla | |
| Neomycin Sulfate Ointment | Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. | H31022262 | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology, USA) | SH30809.01 | |
| Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. |
NA | |
| Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope | Zeiss, Germany | Zeiss LSM800 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
- Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
- Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
- Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
- Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
- Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
- Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
- Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
- Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
- Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
- Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
- Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
- Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
- Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
- Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
- O’Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
- Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
- Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
- Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis – A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
- George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
- Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. , (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
- Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O’Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
- Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
- Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
- Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).
