Effektiv genomredigering av möss genom CRISPR-elektroporering av zygoter

Summary

Här beskriver vi en enkel teknik avsedd för effektiv generering av genetiskt modifierade möss som kallas CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Denna metod levererar redigeringsreagens genom elektroporering till embryon med en effektivitet som närmar sig 100%. Detta protokoll är effektivt för punktmutationer, små genomiska insättningar och deletioner i däggdjursembryon.

Abstract

Med exceptionell effektivitet, noggrannhet och lätthet har CRISPR / Cas9-systemet avsevärt förbättrat genomredigering i cellodling och laboratoriedjurförsök. Vid generering av djurmodeller erbjuder elektroporering av zygoter högre effektivitet, enkelhet, kostnad och genomströmning som ett alternativ till guldstandardmetoden för mikroinjektion. Elektroporering är också mildare, med högre livskraft, och levererar tillförlitligt Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteiner (RNP) i zygoterna hos vanliga laboratoriemusstammar (t.ex. C57BL / 6J och C57BL / 6N) som närmar sig 100% leveranseffektivitet. Denna teknik möjliggör infogning/deletion (indels) mutationer, punktmutationer, deletion av hela gener eller exoner och små infogningar i intervallet 100-200 bp för att infoga LoxP eller korta taggar som FLAG, HA eller V5. Samtidigt som vi ständigt förbättras presenterar vi här det aktuella tillståndet för CRISPR-EZ i ett protokoll som inkluderar sgRNA-produktion genom de vitro-transkription, embryobehandling, RNP-montering, elektroporering och genotypning av preimplantatoriska embryon. En forskare på forskarnivå med minimal erfarenhet av att manipulera embryon kan få genetiskt redigerade embryon på mindre än 1 vecka med hjälp av detta protokoll. Här erbjuder vi en enkel, billig, effektiv, högkapacitetsmetod som kan användas med musembryon.

Introduction

Genomredigering hos levande möss har förenklats avsevärt och har blivit tillgänglig och billigare sedan uppkomsten av CRISPR-redigering ^1,2,3. Initiala djurredigeringsförsök använde mikroinjektion för att leverera CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium ^4,5,6. Medan mikroinjektion är ganska effektiv, kanske mängden övning som krävs för att fullt ut behärska det inte är lämpligt för praktikanter och studenter och kräver också dyr utrustning som ett blygsamt finansierat laboratorium inte har råd med. Mikroinjektion utförs normalt av experttekniker vid transgena anläggningar med scheman och servicepriser som är hastighetsbegränsande för många forskare. Ett mer tillgängligt tillvägagångssätt är elektroporering, vilket har visat sig vara ganska effektivt för leverans av CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA till embryon i pronukleärt stadium⁷. Ytterligare förbättringar av CRISPR-genomredigering och leveransstrategier föreslog att förmonterade RNP som redan är engagerade i sgRNA kan vara ett effektivt sätt att minska mosaicism⁸.

Logiken bakom utvecklingen och användningen av detta protokoll var att kringgå många av de begränsningar och hinder som är förknippade med mikroinjektion. Som namnet antyder skulle en enkel, intern och kostnadseffektiv metod som snabbt kan avgöra om otestade sgRNA-mönster skulle vara värda att använda under ett mikroinjektionsexperiment vara ett mycket bekvämt första pass kvalitetskontrollsteg (figur 1). Även om denna metod inte kan ersätta mikroinjektion för mer komplexa strategier, som att introducera långa donator-DNA-sekvenser för rekombinationsbaserade resultat, är den idealisk för mindre komplexa strategier som små deletioner eller infogningar och taggningsgener. Denna metod är lämplig för forskare med grundläggande embryomanipulationsförmåga som har enkla redigeringsbehov, vill testa sin hypotes inom tidsramen för preimplantatorisk utveckling eller föredrar att testa sgRNA i embryon innan de bokar ett möte med en mikroinjektionsspecialist. Här levereras redigeringsreagens tillfälligt till embryon i pronukleärt stadium som Cas9 / sgRNA RNP via elektroporering (en serie elektriska pulser) för att maximera effektiviteten samtidigt som mosaicism minskar⁸. Med hjälp av en embryogenotypningsmetod finns redigeringsresultat tillgängliga i cirka 1 vecka⁹, vilket minskar behovet av olika mikroinjektionsapplikationer till en betydligt lägre kostnad.

Denna metods effektivitet toppar vid det pronukleära embryostadiet, när embryot ännu inte har smält samman moderns och faderns pronuclei eller gått in i S-fas (figur 2). Superovulation används för att maximera antalet zygoter men producerar både pronucleära zygoter och obefruktade ägg. Friska zygoter kan också väljas före elektroporering för att öka den totala effektiviteten. Eftersom andra elektroporeringsprotokoll effektivt har redigerat zygoter utan att behöva inkludera ett liknande steg 7,10,11,12,13,14,15^, är ett valfritt steg i detta protokoll den lilla erosionen av zona pellucida (ZP). ZP är ett glykoproteinskikt som hjälper spermatozoabindning, akrosomrespons och befruktning kring embryon i pronukleärt stadium. Enligt vår erfarenhet fann vi att en mild syrabaserad erosion av ZP ger tillförlitlig Cas9 RNP-elektroporeringsleverans med endast en marginell inverkan på livskraften.

Vi har observerat RNP-leveranshastigheter på upp till 100% effektivitet via elektroporering i musstammar som vanligtvis används i forskning som C57BL / 6J och C57BL / 6N ^9,16. Oberoende grupper har också utvecklat elektroporeringsbaserade procedurer med effektivitet större än eller matchande mikroinjektion 11,12,13,14,15,17, med elektroporeringsprotokoll som fungerar bra hos råtta^18,19, gris 20,21,22 och ko ²³ , så vi föreslår att läsarna jämför protokollen för att hitta de förhållanden som bäst passar deras experimentella och utrustningsbehov. Systemet som beskrivs här använder vanliga material och utrustning, vilket endast kräver grundläggande embryomanipulationsfärdigheter. Denna teknik är effektiv för en rad redigeringsstrategier, vilket gör denna metod allmänt tillgänglig för forskarsamhället.

Att designa ideala små guide-RNA (sgRNA) är avgörande för effektiv redigering. Vi rekommenderar screening av två till tre sgRNA-strategier per målplats direkt i musembryon, särskilt om muslinjegenerering önskas. När de väl är utformade rekommenderas kloningsfria metoder som in vitro-transkription (IVT) för att producera högkvalitativa sgRNA³. RNP och sgRNA blandas med 30-50 bearbetade embryon i pronukleärt stadium och utsätts för en serie elektriska pulser för att först tillfälligt permeabilisera ZP och cellmembranet, med efterföljande pulser för att hålla porerna öppna och elektrofores RNP genom zygoten²⁴. Efter optimering fann vi att sex 3 ms pulser vid 30 V för bulkembryon (~ 50) var optimala för redigeringseffektivitet och livskraft, vilket gav mycket effektiv Cas9 / sgRNA RNP-leverans ^9,16,25. Redigeringshändelser i enskilda musmorula kan bekräftas med hjälp av en mängd olika valideringsstrategier som är vanliga för CRISPR-redigering, såsom restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP), T7-endonukleassmältning och Sanger-sekvensering av området av intresse²⁶.

Den nuvarande metoden är mest lämplig för enkla redigeringsscheman (figur 3), såsom infogning/raderingar (indels), exon-stora raderingar i storleksordningen 500-2000 bp och leverans av punktmutationer och små infogningar som C- eller N-terminaltaggar (t.ex. FLAG, HA eller V5)^9,16,27. Potentialen för komplex genomredigering, som stora infogningar av fluorescerande taggar eller villkorade alleler, är fortfarande osäker och är för närvarande fokus för kommande förbättringar.

Denna metod är lätt att bemästra och kan användas för att snabbt testa sgRNA i odlade musembryon i 1 vecka⁹ (figur 1). I detta arbete presenteras ett sexstegsprotokoll, som inkluderar 1) sgRNA-design; 2) sgRNA-syntes; 3) superovulation och parning; 4) embryoodling, insamling och bearbetning; 5) RNP-montering och elektroporering; 6) embryoodling och genotypning. Information om alla material som används tillhandahålls (Materialförteckning). Som en positiv kontroll har reagenser för att redigera tyrosinas (Tyr) lokus ^9,16 tagits med i tilläggstabell 1.

Protocol

All djurvård och användning i hela detta protokoll följde Animal Welfare Act-policyer, ILAR Guide for Care and Use of Laboratory Animals och följde riktlinjer från AVMA för eutanasi och University of Pennsylvania Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer och policyer. Djurvårds- och användningsprotokollet granskades och godkändes av University of Pennsylvania IACUC för detta projekt. Som en fråga om överensstämmelse och försiktighet, vänligen sök efter alla nödvändiga tillstånd inn…

Representative Results

Denna metod genererar mer än 100 μg sgRNA (20 μL vid >6,000 ng / L koncentration) för effektiv Cas9 / sgRNA RNP-montering. Den rutinmässiga superovulationsmetoden som beskrivs här producerar vanligtvis 10-20 livskraftiga embryon per pluggad hona. På grund av hanteringsfel och typiska förluster i samband med embryomanipulation är en förväntad 80% av embryon befruktade, livskraftiga och i utmärkt skick efter elektroporering. För att hjälpa forskare att genomföra ett framgångsrikt experiment har vi tillhanda…

Discussion

Här presenteras en enkel och mycket effektiv redigeringsteknik för musgenom. Elektroporering kan användas för att generera modifierade embryon på 1-2 veckor (figur 1) och kan producera redigerade möss inom 6 veckor⁹. Jämfört med samtidigt utvecklade elektroporeringsbaserade protokoll som levererar RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, är metoden som beskrivs här konceptuellt likartad och erbjuder effektivitet i samma intervall<sup class="xre…

Materials

0.1-cm-gap electroporation cuvette	Bio-Rad	cat. no. 1652089	Electroporation
26-G, 1/2-inch needle	BD	cat. no. 305111	Superovulation
3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice	JAX	cat. no. 000664	Superovulation
35-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 627-160	Embryo Culture
60-mm Tissue culture dish	Greiner Bio-One,	cat. no. 628-160	Embryo Processing
6x loading dye	Thermo Fisher Scientific	cat. no. R0611	sgRNA Synthesis and Genotyping
Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade	Sigma-Aldrich,	cat. no. T1788	Embryo Processing
BSA, embryo culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. A3311	Embryo Processing and Culture
Cas9 protein	Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS	cat. no. 1074181	Electroporation
DNase I, RNase-free	New England BioLabs,	cat. no. M0303	sgRNA Synthesis
DPBS(calcium and magnesium free)	Gibco	cat. no. 14190-144	Embryo Processing
EcoRI	NEB	cat. no. R3101S	Genotyping
EDTA, anhydrous	Sigma-Aldrich	cat. no. EDS-100G	RNP Buffer
Ethanol	Koptec	cat. no. V1016	sgRNA Synthesis
Gelatin (powder) type B, laboratory grade	Fisher,	cat. no. G7-500	Lysis Buffer
Glycerol, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP229	RNP Buffer
Taq Polymerase	Promega	cat. no. M712	Genotyping
HEPES, cell culture grade	Sigma-Aldrich	cat. no. H4034	RNP Buffer
HinfI (10,000 U/mL)	NEB	cat. no. R0155S	Genotyping
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England BioLabs,	cat. no. E2040	sgRNA Synthesis
Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG)	Millipore	cat. no. 230734	Superovulation
Hyaluronidase/M2	Millipore	cat. no. MR-051-F	Embryo Processing
KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids)	Zenith Biotech	cat. no. ZEKS-050	Embryo Culture
LE agarose, analytical grade	BioExpress	cat. no. E-3120-500	sgRNA Synthesis and Genotyping
M2 medium	Zenith Biotech	cat. no. ZFM2-050	Embryo Processing
Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. no. M8266	RNP and Lysis Buffer
Mineral Oil	Millipore	cat. no. ES-005C	Embryo Culture
Nonidet P-40,substitute (NP-40)	Sigma-Aldrich	cat. no. 74385	Lysis Buffer
Nuclease-free water, molecular-biology grade	Ambion	cat. no. AM9937	sgRNA Synthesis and Genotyping
Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping	Integrated DNA Technologies	custom orders	sgRNA Design
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific	cat. no. 31985062	Embryo Culture
High-fidelity DNA polymerase	New England BioLabs,	cat. no. M0530	sgRNA Synthesis
Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl)	Sigma-Aldrich	cat. no. P9333	RNP and Lysis Buffer
Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG)	ProspecBio	cat. no. HOR-272	Superovulation
Proteinase K, molecular-biology grade	Fisher	cat. no. BP1700-100	Lysis Buffer
RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube	VWR	cat. no. 20170-333	sgRNA Synthesis and Genotyping
RNase-free eight-well PCR strip tubes	VWR	cat. no. 82006-606	sgRNA Synthesis and Genotyping
Magnetic purification beads	GE Healthcare	cat. no. 65152105050250	sgRNA Synthesis
Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	cat. no. C4706	RNP Buffer
Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade	Teknova	cat. no. T1085	Lysis Buffer
Tween 20 molecular-biology grade	Sigma-Aldrich	cat. no. P7949-500	Lysis Buffer